比利时杜鹃花黄烷酮3-羟化酶基因克隆及功能分析

摘要

黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)是植物花青素(anthocyanin)合成过程中的关键酶。本研究以红色比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort.)不同发育时期的花瓣为实验材料,利用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术对比利时杜鹃花黄烷酮3-羟化酶(Rhododendron hybridum Hort.flavanone 3-hydroxylase,RhF3H)基因进行克隆,并进行生物信息学分析;利用qRT-PCR技术对不同发育时期花瓣RhF3H基因表达量进行分析;构建pET-28a-RhF3H原核表达载体对RhF3H蛋白进行制备和纯化;构建pCAMBIA1302-RhF3H过表达载体,通过农杆菌介导法进行拟南芥遗传转化研究。结果表明,比利时杜鹃花RhF3H基因全长为1245 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为1092 bp,编码363个氨基酸,含有Fe2+结合基序和2-酮戊二酸结合基序的双加氧酶超家族。系统进化分析表明,比利时杜鹃花RhF3H蛋白与越橘F3H蛋白亲缘关系最近;实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)分析表明,在不同发育时期花瓣中,红色比利时杜鹃花RhF3H基因的表达水平呈先上升后下降的趋势,在初开期表达量最高;原核表达结果表明,构建原核表达载体pET-28a-RhF3H诱导蛋白大小约为40 kDa,与理论值相近;成功获得转基因RhF3H拟南芥植株,PCR鉴定和β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)染色证明RhF3H基因整合到拟南芥植株基因组中。qRT-PCR、总黄酮和花青素含量分析显示,相对于野生型,RhF3H在转基因拟南芥植株中显著高表达,其总黄酮和花青素含量也显著增加。本研究为探究杜鹃花RhF3H基因功能提供一定的理论基础,对杜鹃花花色的分子机理有重要的研究价值。