靶向性反向半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3重组腺病毒诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

摘要

目的 观察靶向性反向半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(r-caspase-3)重组腺病毒体外诱导肝癌细胞凋亡的效果和特异性.方法 构建甲胎蛋白(AFP)增强子和白蛋白(ALB)启动子腺病毒载体(pAdTrack-EAFP-PALB),亚克隆r-caspase-3至载体pAdTrack-EAFP-PALP,Pme Ⅰ线性化pAdTrack-EAFP-PALB/r-caspase-3,电转化至BJ/AdEasy菌,获得重组腺病毒骨架pAdeasy-EAFP-PALB/r-caspase-3.Pac Ⅰ酶切后脂质体转染AD293细胞进行包装、扩增、获得病毒.绿色荧光蛋白(GFP)监测病毒滴度和感染效率;RT-PCR和Western印迹法检测r-caspase-3在HepG2细胞中的表达;流式细胞术检测其特异性诱导肝癌细胞凋亡的作用.结果 穿梭载体pAdTrack-EAFP-PALB/r-caspase-3酶切、测序正确.穿梭载体、pAdeasy-1载体同源重组后PCR及Pac Ⅰ酶切鉴定结果表明pAdeasy-EAFP-PALB/r-caspase-3重组成功.转染AD293细胞后可观察到GFP的表达.病毒感染HepG2细胞总DNA经RT-PCR和Western印迹均可检测到目的 基因的表达,证实Ad-EAFP-PALB/r-caspase-3病毒颗粒包装成功;靶向性r-caspase-3重组腺病毒感染各组细胞24 h后,各组凋亡指数分别为:HepG细胞48.2%、7721细胞17.7%、L-02细胞7.3%、MDA-MB-231细胞0%.结论 成功构建了靶向性Ad-EAFP-PALB/r-caspase-3重组腺病毒,体外实验表明其具有凋亡诱导靶向性,为进一步研究靶向性r-caspase-3基因治疗肝细胞肝癌及其生物学功能提供了依据.