可活化细胞穿膜肽-聚N-（2-羟丙基）甲基丙烯酰胺-Ad.mda-7.egfp接合物的合成及跨膜运输途径检测

摘要

目的：合成一种由可活化细胞穿膜肽（ACPP）、水溶性高分子聚合物聚N?（2?羟丙基）甲基丙烯酰胺（pHPMA）修饰腺病毒的接合物，并初步探索该接合物的跨膜运输途径。方法通过化学合成的方法合成ACPP。将肺腺癌细胞株A549、乳腺癌细胞株MDA?MB?231、肺支气管上皮细胞株HBE和肝癌细胞株HepG2均分为两组，分别加入培养基及终浓度为10 mg/L基质金属蛋白酶抑制剂强力霉素，12 h后加入ACPP，通过荧光显微镜观察并鉴定ACPP对各细胞的穿膜活性。通过化学修饰法合成接合物pc?Ad. mda?7.egfp及ACPP?pc?Ad.mda?7.egfp，通过荧光显微镜观察并初步鉴定接合物的合成和对A549细胞的穿膜活性。应用流氏细胞术检测接合物感染A549细胞的能力。通过荧光显微镜观察并鉴定接合物ACPP?pc?Ad. mda?7. Egfp在A549细胞内定位及穿膜活性。结果合成了ACPP 100 mg。ACPP对A549、MDA?MB?231、HepG2细胞株具有靶向性穿膜活性，而HBE细胞内未见绿色荧光，强力霉素组细胞经过强力霉素作用后与ACPP?FITC孵育，4种细胞内均未见明显绿色荧光反应，强力霉素阻断了ACPP的肿瘤选择性穿膜作用。合成了两种接合物pc?Ad.mda?7.egfp（粒径420.6 nm）及ACPP?pc?Ad.mda?7.egfp（粒径462.2 nm）。将ACPP?pc?Ad.mda?7.egfp、pc?Ad.mda?7.egfp接合物、Ad.mda?7.egfp与A549细胞共培养后，可见空白对照组（培养基）无绿色荧光蛋白表达，pc?Ad.mda?7.egfp接合物仅见微量绿色荧光蛋白表达，ACPP?pc?Ad.mda?7.egfp、Ad.mda?7.egfp组所有细胞均可见强烈绿色荧光蛋白表达。经流氏细胞仪检测，ACPP?pc?Ad.mda?7.egfp组A549细胞PI荧光值明显高于pc?Ad.mda?7. egfp组。经荧光显微镜观察证实接合物ACPP?pc?Ad.mda?7.egfp大量分布于A549细胞胞质，而pc?Ad. mda?7.egfp仅出现少量内吞性囊泡。结论成功合成了ACPP?pc?Ad.mda?7.egfp接合物，并证实ACPP?pc?Ad.mda?7.egfp以非内吞途径进行跨膜运输。