限制性内切酶介导的粉红粘帚霉67-1转化体系构建

摘要

本文将含有潮霉素抗性基因（hph）的质粒pAN7-1通过限制性内切酶介导法转入植病生防真菌粉红粘帚霉Clonostachys rosea 67-1中,并由此建立该生防真菌的遗传转化体系。研究结果表明,PEG介质含量、限制性内切酶种类和浓度、质粒形态和反应时间对转化效率具有显著的影响。当质粒经线性化后加入40%PEG3350和20 U HindⅢ,室温下转化10 min时,转化效率可达到30～40 CFU.μg 1质粒DNA。PDA平板上连续培养3代,再转接到潮霉素抗性平板中,获得遗传稳定的转化子。PCR检测、Southern杂交和Real-time PCR检测等证明hph基因已整合到基因组中,且多为单拷贝插入。对随机挑取的50个转化子生长性状的测定结果表明,20%的转化子在PDA培养基中生长较快,12%的转化子产孢水平较高;另有16%～20%的转化子生长缓慢、产孢量减少;还有4%的转化子生长微弱,且无明显产孢现象。上述方法可以成功用于在粉红粘帚霉中引入外源基因,为今后生防粘帚霉高效工程菌株的构建提供了依据。