去泛素化酶在皮质神经元缺糖缺氧再灌注损伤后坏死样凋亡中的表达

摘要

目的探讨去泛素化酶（Cylindromatosis,CYLD）在皮质神经元中的定位及缺糖缺氧再灌注损伤后神经元坏死样凋亡中的表达变化。方法①皮质神经元培养6 d,免疫荧光观察4,6-联脒-2-苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）核染及神经元特异性标志物β3-tubulin表达,验证培养神经元的纯度。②原代皮质神经元细胞培养14 d,通过成熟神经元特异性标志物NeuN鉴定神经元,DAPI染核,同时用免疫荧光共定位观察目的蛋白CYLD在神经元内的定位。③培养14 d的神经元首先被分为正常对照组（Control组）,无糖Earle’s平衡盐组（EBSS组）,Dmso组缺糖缺氧（OGD）复灌不同时间组（0 h、2 h、6 h、8h、12 h）组。预给予广谱抗凋亡抑制剂（zVAD-fmk,zVAD）20μmol/L、30 min,缺糖缺氧2 h,复灌不同时间点,通过Western、比色法检测神经元CYLD蛋白水平变化、乳酸脱氢酶（LDH）水平。④随后神经元被分为正常对照、OGD组,给予缺糖缺氧2 h,复灌8 h,通过Western blot观察细胞浆、核内CYLD蛋白表达变化情况。结果 CYLD在神经元中定位于细胞核、胞浆,胞浆CYLD随着缺糖缺氧后复灌时间的延长,8h到达高峰（P＜0.05）,与LDH[分别为Control组（1.00±0.00）,EBSS组（1.07±0.03）,DMSO组（1.09±0.03）,0 h组（1.40±0.12）,2 h组（1.74±0.08）,6 h组（2.25±0.12）,8 h组（2.97±0.15）,12 h组（3.01±0.08）]水平变化一致（P＜0.05）,随后降低;细胞核内CYLD蛋白在缺糖缺氧2 h,复灌8 h后无明显变化（P＞0.05）。结论 去泛素化酶CYLD在胞浆中参与皮质神经元缺糖缺氧再灌注损伤后的坏死样凋亡,下调其表达可能保护脑缺血再灌注损伤。