血小板生成素双体分子的融合构建、原核表达及其分子结构特性预测

摘要

目的:为了研制更稳定、高效、低毒的血小板生成素(TPO),拟设计构建TPO的双体分子(T-T)并在原核中表达,同时预测其融合蛋白的分子结构特性.方法:采用分子克隆方法分别构建TPO单体分子与双体分子的原核表达载体pET32/TPO和pET32/T-T,并在大肠杆菌中进行表达,以Western blot鉴定表达产物;用生物信息学方法DSGene1.1和ProtScale软件,对该融合蛋白的结构特征如电点、柔性、抗原性及亲水性等进行模拟分析.结果:成功构建TPO双体分子pET32/T-T的原核表达载体,并经Nco I和Not I双酶切电泳及测序证实.通过转化origamiTM(DE3)感受态菌及IPTG诱导获得高效表达,其产量在40%以上;Western blot显示表达产物能与抗TPO单克隆抗体特异性结合.对T-T双体分子融合蛋白的结构特性预测表明,其融合蛋白中的两个TPO单体分子等电点、抗原性及亲水性均无显著改变,接头处具有高柔性.与TPO的原始序列相比,T-T的一级结构中有2个氨基酸发生改变,在接头(L)后插入一段34个氨基酸的新序列(N).此序列具有一定的抗原性和亲水性,呈现β片层结构.结论:本研究所构建表达的TPO单体和T-T双体分子均可在大肠杆菌中获高效表达,T-T双体分子的结构预测符合设计要求,为进一步研究新型T-T双体分子融合蛋白的生物学特性提供了基础.