天蚕抗菌肽AD基因在AcNPV载体系统中的表达研究

摘要

目的研究利用昆虫杆状病毒载体系统在昆虫培养细胞和虫体中高效表达新型多肽抗生素天蚕抗菌肽AD(cecropin AD,CAD).方法采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)点突变技术改造CAD基因,改造后的CAD基因先克隆到质粒pGEM-T easy vector中进行鉴定和序列分析,然后再亚克隆到苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus,AcNPV)表达载体pAcGP67B中,获得重组病毒载体pAcAD.用重组病毒载体pAcAD和野生AcNPVDNA共感染草地夜蛾(Spodoptera frugiperdoda)Sf9细胞,经空斑法筛选得到重组病毒AcNPVAD.重组病毒AcNPVAD经PCR扩增鉴定,证实了CAD基因已经整合到重组病毒AcNPVAD中.结果以AcNPVAD转染Sf9细胞和苜蓿丫纹夜蛾幼虫,抑菌活性试验证实CAD基因在昆虫培养细胞Sf9和苜蓿丫纹夜蛾幼虫虫体中均得到表达,表达产物具有抑菌作用.通过离子交换层析,杂蛋白基本去除,重组抗菌肽获得初步纯化,重组抗菌肽活性峰位于0.75mol/L处.结论CAD基因在昆虫杆状病毒载体系统获得了表达,表达产物具有抑菌活性.