B群链球菌及其大环内酯类耐药基因LAMP快速可视化检测方法的建立和初步应用

摘要

目的建立一种快速可视化检测B群链球菌(GBS)及其大环内酯类耐药基因的环介导恒温扩增(LAMP)方法,为临床GBS检测提供新方法。方法针对GBS特异性基因cfb和大环内酯类耐药基因ermB、mefA/E和linB设计LAMP反应的引物;建立并优化LAMP的反应体系和反应条件,反应结果通过DNA扩增曲线和肉眼观察反应液颜色变化判断;以携带上述基因的质粒DNA为检测标准,确定LAMP方法检测目标基因的敏感性与特异性,并与PCR方法的检测结果比较;采用LAMP方法检测临床300份孕产妇阴道直肠拭子标本中GBS,与分离培养法的检出率进行统计学分析;采用LAMP方法检测80株GBS临床分离株中大环内酯类耐药基因,并与药敏试验结果进行统计学分析。结果建立了快速可视化检测GBS及其大环内酯类耐药基因的LAMP反应体系和方法,该法在63℃、45 min内完成;该法能够特异性检测pMD-cfb、pMD-ermB、pMD-mefA/E、pMD-linB质粒DNA,其灵敏度为10-5 ng/μL,是PCR方法灵敏度的100倍;对300份孕产妇阴道直肠拭子标本进行检测,LAMP方法对GBS检出率为12.7%,分离培养检出率为11.3%,两者没有统计学差异(P>0.05);药敏试验和LAMP方法检测80株GBS中大环内酯类耐药菌株的检出率分别为53.8%和48.8%,二者没有统计学差异(P>0.05)。结论本研究建立的GBS及其大环内酯类耐药基因LAMP检测方法具有特异性好、灵敏度高、快速、结果可视等优点,对临床新生儿GBS疾病的预防和治疗具有重要意义。