CTSD对黔北麻羊卵泡颗粒细胞的调控机制及功能分析

摘要

旨在分析组织蛋白酶D(cathepsin D,CTSD)对黔北麻羊卵泡颗粒细胞的调控机制并初步探究其对产羔性状的影响机理.本研究以36周龄、健康、多胎黔北麻羊母羊(n=5)为研究对象,屠宰后采集卵巢组织分离培养卵泡颗粒细胞,构建真核表达载体pEGFP-N3-CTSD,将其导入细胞后在转录与翻译水平验证真核表达效率;通过CCK-8法检测在不同时间段内重组质粒对颗粒细胞增殖的影响;通过流式细胞仪检测重组质粒对颗粒细胞凋亡及周期的影响;随后使用RT-qPCR法在细胞水平检测重组质粒对细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3,细胞周期相关因子Cyclin A1、Cyclin D2、Cyclin E mRNA表达水平的影响,最后,以多胎性状候选基因BMPR-IB、FSHR、INHA为功能基因,在转录与翻译水平上验证重组质粒对其mRNA与蛋白表达的影响.双酶切及测序结果证实,黔北麻羊CTSD基因真核表达载体pEGFP-N3-CTSD构建成功,且在转录与翻译水平极显著上调CTSD在颗粒细胞中的表达(P<0.01);细胞增殖检测结果表明,颗粒细胞中上调CTSD后能够抑制细胞的增殖,其中在12、24、48、72 h对细胞增殖的抑制效率达到极显著(P<0.01);细胞凋亡检测结果表明,CTSD的过表达能够极显著促进颗粒细胞的凋亡(P<0.01),且能够显著下调细胞抗凋亡基因Bcl-2的表达(P<0.05),极显著上调细胞促凋亡相关基因Bax、Caspase-3的表达(P<0.01);此外,细胞周期检测发现,pEGFP-N3-CTSD在转染后能够极显著上调G0/G1期与G2/M期的细胞数量(P<0.01),极显著下调S期细胞数量(P<0.01),同时能够极显著提高细胞周期相关因子Cyclin A1的表达(P<0.01),极显著降低Cyclin D2的表达(P<0.01).RT-qPCR及Western blot检测结果表明,在颗粒细胞中上调CTSD后,能够极显著的下调多胎性状候选基因与蛋白BMPR-IB、FSHR、INHA在转录和翻译水平中的表达(P<0.01).本研究发现,CTSD的高表达能抑制细胞的增殖,促进细胞凋亡,改变颗粒细胞的周期进程;还能改变细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase-3与细胞周期相关因子Cyclin A1、Cy-clin D2、Cyclin E的表达;同时也能够极显著降低颗粒细胞中多胎性状候选基因与蛋白BMPR-IB、FSHR、INHA的表达量(P<0.01).这提示,CTSD可能通过改变细胞水平相关因子的表达量来调控颗粒细胞的生物学行为以及影响山羊多胎性状候选基因的表达进而间接的成为影响山羊产羔性状的重要因子,本研究为进一步探明C T SD对山羊产羔性状调控机理及对颗粒细胞的影响机制奠定基础.