毒害艾美耳球虫和产气荚膜梭菌双重PCR检测方法的建立

摘要

旨在初步建立可同时检测毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)和产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的双重PCR及纳米PCR检测方法。基于E.necatrix的ITS-2基因和C.perfringens的α毒素基因分别设计、筛选靶基因位点的特异性扩增引物,通过反应体系和退火温度的优化,建立适用于两种病原的特异性双重PCR和双重纳米PCR检测方法;用所建立的方法对6种其它常见寄生性原虫和3种其他细菌进行PCR扩增以验证其特异性;构建两种病原的重组质粒pMD19-T-ITS2和pMD19-T-cpa,将其按10倍倍比稀释成不同浓度梯度的质粒模板用于所建方法的敏感性试验。结果表明:两种方法均能特异性扩增出E.necatrix约150 bp和C.perfringens约400 bp的目的片段,且所建立的两种检测方法对其他6种其他原虫和3种其他细菌的检测结果均为阴性;双重PCR扩增E.necatrix和C.perfringens的最低模板检出量分别是181和1050 copies,而双重纳米PCR的最低模板检出量分别是1.81和105 copies;临床检测结果显示,所建立的2种方法与临床病原学检测结果一致。成功建立了用于E.necatrix和C.perfringens双重PCR和双重纳米PCR检测方法,且敏感性好、特异性高,可为临床上毒害艾美耳球虫和产气荚膜梭菌感染的检测提供技术支持。