牛PAI-1基因真核表达载体构建、生物信息学分析及功能初探

摘要

本研究旨在构建牛纤溶酶原激活物抑制剂1 (Plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)基因真核表达载体、生物信息学分析并对其功能进行初探.实验参照GenBank数据库公布的牛PAI-J基因的CDS序列信息设计引物,通过RT-PCR获得PAI-1基因片段,将基因片段与pMD-19-T载体连接转化DH5α感受态细胞,构建pMD-19-T-PAI-1克隆载体,双酶切回收基因片段,构建pcDNA3.1-PAI-1真核表达载体,经双酶切、测序鉴定构建成功.将表达载体转染至293T细胞,48 h后进行荧光定量PCR (RT-qPCR)和Western Blot检测PAI-1以及凋亡相关基因Bcl2、Bax和Caspase-3的表达.结果 显示:pcDNA3.1-PAI-1真核表达载体测序结果与GenBank数据库公布的牛PAI-J基因CDS序列完全匹配,生物信息学分析发现PAI-1基因编码区全长1 209 bp,编码402个氨基酸,存在35个潜在磷酸化位点,主要分布在细胞外.过表达PAI-1可显著提高293T细胞中PAI-1 mRNA和蛋白表达,抗凋亡基因Bcl2 mRNA和蛋白水平显著升高,促凋亡基因Bax和Caspase-3 mRNA和蛋白水平显著降低.