内皮Adora2b活化可减轻脂多糖诱导的肺微血管内皮炎症

摘要

目的 探讨内皮低亲和力A2b腺苷受体（Adora2b）对脂多糖（LPS）诱导肺微血管内皮炎症的调控作用及机制。方法 原代培养大鼠肺微血管内皮细胞（PMVEC）,血清饥饿24 h后,采用Adora2b特异性激动剂BAY60-6583（0.1、1、10 μmol/L）或抑制剂PSB1115（1 μmol/L）预处理1 h,然后再加入LPS（100 μg/L）；同时设立空白对照组、LPS组、BAY60-6583单独处理组和PSB1115单独处理组。各组细胞培养24 h后,采用膜联蛋白V/碘化丙啶（Annexin V/PI）双染色法检测早期细胞凋亡率,用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定细胞上清液中炎性因子含量,用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）测定趋化因子和黏附分子的mRNA表达；分离提取大鼠静脉血中性粒细胞（PMN）,观察体外PMN黏附迁移情况,用异硫氰酸荧光素-白蛋白（FITC-albumin）法检测PMN黏附迁移后PMVEC单层通透性,用荧光探针DCFH-DA检测细胞内氧化应激水平。结果 与空白对照组相比,LPS组早期细胞凋亡率明显升高,上清液中早期炎性因子白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量明显增加,趋化因子如CXC基序趋化因子配体1（CXCL-1）、CXC基序趋化因子配体3（CXCL-3）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）以及黏附分子如E -选择素、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）的mRNA表达均明显升高,黏附迁移的PMN增多,PMVEC单层通透性升高,细胞内活性氧水平升高。与LPS组比较,BAY60-6583预处理能剂量依赖性地降低早期细胞凋亡率,减少PMN迁移,降低PMVEC单层通透性,0.1 μmol/L时差异即有统计学意义〔凋亡率：（21.12±2.12）%比（27.66±3.57）%,PMN迁移细胞数（个/HP）：260.60±18.24比290.20±16.48,通透系数（Pd,×10-6 cm/s）：28.28±2.04比32.55±2.13,均P＆0.05〕,并能剂量依赖性减少早期促炎因子分泌,降低趋化因子和黏附分子的mRNA表达,1 μmol/L时差异均有统计学意义〔IL-1β（ng/L）：475.75±63.15比755.25±67.42,TNF-α（ng/L）：560.25±69.96比818.75±60.92,CXCL-1 mRNA（2-ΔΔCt）：3.57±0.28比5.27±0.69,CXCL-3 mRNA（2-ΔΔCt）：4.56±0.48比7.32±0.54,MCP-1 mRNA（2-ΔΔCt）：2.21±0.31比3.35±0.21,E -选择素mRNA（2-ΔΔCt）：4.64±0.09比7.28±0.73,ICAM-1 mRNA（2-ΔΔCt）：4.14±0.30比5.89±0.25,VCAM-1 mRNA（2-ΔΔCt）：2.23±0.19比2.92±0.33,均P＆0.05〕,10 μmol/L BAY60-6583预处理还能降低细胞内氧化应激水平〔活性氧（荧光强度）：629.05±33.10比781.45±64.59,P＆0.05〕；而PSB1115预处理能进一步增加LPS诱导的细胞凋亡〔凋亡率：（34.36±4.57）%比（27.66±3.57）%〕,上调炎性因子和趋化因子、黏附分子的表达〔IL-1β（ng/L）：889.00±63.11比755.25±67.42,TNF-α（ng/L）：939.00±43.44比818.75±60.92,CXCL-1 mRNA（2-ΔΔCt）：6.66±0.65比5.27±0.69,CXCL-3 mRNA（2-ΔΔCt）：10.42±0.51比7.32±0.54,MCP-1 mRNA（2-ΔΔCt）：4.85±0.34比3.35±0.21,E -选择素mRNA（2-ΔΔCt）：8.42±0.47比7.28±0.73,ICAM-1 mRNA（2-ΔΔCt）：7.46±0.72比5.89±0.25,VCAM-1 mRNA（2-ΔΔCt）：4.35±0.26比2.92±0.33〕,并能增加PMN黏附迁移（个/HP：348.40±22.68比290.20±16.48）及PMVEC单层通透性〔Pd（×10-6 cm/s）：39.65±2.69比32.55±2.13〕,加重氧化应激损伤〔活性氧（荧光强度）：847.04±29.26比781.45±64.59〕,差异均有统计学意义（均P＆0.05）。结论 内皮Adora2b活化可通过减少早期炎性因子释放、下调细胞趋化和黏附分子表达、减少PMN黏附迁移、降低氧化应激等机制减轻LPS诱导的肺微血管内皮炎症。