低表达LATS1通过抑制Hippo信号通路促进间充质干细胞的分化增殖和迁移

摘要

目的探讨低表达大肿瘤抑制因子1（LATS1）基因抑制Hippo信号通路对小鼠骨髓来源间充质干细胞（mMSCs）分化、增殖和迁移能力的影响。方法将C57BL/6小鼠mMSCs分为正常对照组（MSC组）、空载体对照组（MSC-GFP组）、过表达LATS1实验组（MSC-LATS1组）、空干扰病毒转染组（MSC-shControl组）、转染干扰LATS1病毒组（MSC-shLATS1组）,分别构建过表达或低表达LATS1的慢病毒载体及其空载体对照并转染mMSCs。用荧光显微镜和流式细胞仪评估慢病毒转染效率;用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测LATS1 mRNA表达,用蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测LATS1、磷酸化YAP（p-YAP）、14-3-3蛋白表达,以明确LATS1对Hippo信号通路的调控作用;用茜素红、油红O染色及qRT-PCR检测成骨转录因子Runx2、OSX及成脂转录因子C/EBPα、PPAR-γ的mRNA表达,以明确Hippo信号通路对mMSCs成骨及成脂分化的影响;用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测mMSCs的数量,以评估Hippo信号通路对mMSCs增殖能力的影响;用划痕实验及Transwell小室迁移实验评估Hippo信号通路对mMSCs水平及垂直迁移能力的影响。结果慢病毒载体转染mMSCs效率可达94.74%~96.10%。与MSC-GFP组比较,MSC-LATS1可激活Hippo信号通路[LATS1 mRNA(2-△△CT):4.37±0.21比1.20±0.04,LATS1蛋白（灰度值）:2.21±0.06比1.09±0.10,p-YAP/YAP蛋白比值（灰度值）:1.51±0.13比0.98±0.05,14-3-3蛋白（灰度值）:1.92±0.18比1.10±0.09,均P＜0.05],抑制mMSCs成骨及成脂分化[钙质沉积（A值）:0.13±0.02比0.40±0.03,Runx2 mRNA(2-△△CT):0.51±0.02比0.98±0.09,OSX mRNA(2-△△CT):0.41±0.04比1.04±0.09,脂质沉积（A值）:0.10±0.02比0.25±0.03,C/EBPαmRNA(2-△△CT):0.33±0.03比1.11±0.09,PPAR-γmRNA(2-△△CT):0.29±0.02比1.04±0.10,均P＜0.05],抑制4~7 d的MSC增殖及mMSCs水平和垂直迁移能力[划痕弥合程度:（18.65±3.53）%比（40.29±1.87）%,迁移至Transwell小室膜下层的细胞数（个/MP）:35.99±6.18比103.67±17.77,均P＜0.05]。与MSC-shControl组比较,MSC-shLATSl可以抑制Hippo信号通路[LATS1 mRNA(2-△△CT):0.16±0.01比0.98±0.03,LATS1蛋白（灰度值）:0.38±0.03比1.04±0.07,p-YAP/YAP蛋白比值（灰度值）:0.58±0.04比1.05±0.06,14-3-3蛋白（灰度值）:0.14±0.02比1.02±0.09,均P＜0.05],促进mMSCs成骨及成脂分化[钙质沉积（A值）:0.93±0.13比0.44±0.05,Runx2mRNA(2-△△CT):1.44±0.12比0.95±0.04,OSXmRNA(2-△△CT):1.67±0.06比1.10±0.11,脂质沉积（A值）:0.47±0.06比0.28±0.04,C/EBPαmRNA(2-△△CT):3.98±0.61比0.99±0.10,PPAR-γmRNA(2-△△CT):3.05±0.36比0.98±0.14,均P＜0.05],促进3~7 d的MSC增殖及mMSCs水平和垂直迁移能力[划痕弥合程度:（80.18±6.98）%比（46.18±1.01）%,迁移至Transwell小室膜下层的细胞数（个/MP）:212.69±41.21比115.87±35.15,均P＜0.05]。结论低表达LATS1可通过抑制Hippo信号通路促进小鼠mMSCs的成骨及成脂分化,增强其增殖和迁移能力。