用PCR-DGGE和qRT-PCR方法检测饲喂含干玉米蒸馏物和浓缩丹宁后牛瘤胃内产甲烷菌的多样性

摘要

浓缩丹宁(CT)和纯玉米型酒精糟能降低反刍动物肠道CH4的产量及其抗微生物及高脂成分。但浓缩丹宁和纯玉米型酒精对瘤胃内产甲烷菌的多样性的影响还未检测。试验旨在利用PCR梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)和实时定量PCR(qRT-PCR)检测饲喂纯玉米型酒精糟(DDG)和从Acacia mearnsii提取的丹宁对瘤胃内产甲烷菌多样性的影响。试验用8头安装瘤胃瘘管的母牛,采用4×4拉丁方设计,共4期试验,每期35d。试验用处理日粮(DM):①对照组(Ctrl),0g DDG;②200g DDG;③400g DDG;④400g DDG+CT(25g)。在每期试验第25和28天的饲喂前从瘤胃4点采集食糜样。总DNA提取自瘤胃食糜中(如0.5mL液相+0.5g固相食糜混合)来获取16SrRNA基因扩增片段,PCR产物用于进行PCR-DGGE分析。PCR-DGGE检测的第1期和第2期的产甲烷菌形成一个簇,第3期和第4期的产甲烷菌形成另一个簇。通过对PCR-DGGE的所有25个条带进行鉴定,其中有16个条带成功克隆和测序。11个条带的测序结果表明,该微生物的基因与Methanobrevi-bacter sp.有97%～100%的相似性,序列的系统发育聚簇分析也证实了该结论。剩余条带同Methanosphaera stadma-nae进行聚簇分析。尽管日粮对总的产甲烷菌无影响,但增加DDG使条带4、5、6、7、9、11中的含量增加而条带16和18中的含量降低。所有处理日粮除400g DDG+CT外均有条带13和19,定量RT-PCR分析证实所有产甲烷菌基因的16SrRNA拷贝数在处理日粮间无差异。PCR-DGGE和RT-PCR结果说明包括DDG及DDG和CT混合物会改变瘤胃中产甲烷菌的多样性但不会改变瘤胃内产甲烷菌的16SrRNA总量,然而说明一些产甲烷的特定种属的拷贝数可以用于解释瘤胃产甲烷菌的多样性。