布鲁氏菌侵染过程中has-miR-5196-3p对炎症小体的调控作用

摘要

试验旨在研究miRNA分子has-miR-5196-3p在布鲁氏菌侵染THP1细胞过程中对NOD样受体蛋白3炎症小体(NLRP3)的调控作用.运用TargetScan、MiRDB等生物信息学预测网站预测has-miR-5196-3p和NLRP3-3'UTR的结合位点,构建其野生型及突变型双荧光素酶报告载体,分别与has-miR-5196-3p mimics及阴性对照共转染293T细胞,通过双荧光素酶报告系统检测各组相对荧光素酶活性的变化,验证has-miR-5196-3p和NLRP3-3'UTR的靶向关系;布鲁氏菌侵染THP1细胞,实时荧光定量PCR检测NLRP3、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(caspase1)及 has-miR-5196-3p mRNA 的表达情况,Western blotting 检测 NLRP3和 caspase1 蛋白表达水平;将has-miR-5196-3p mimics、has-miR-5196-3p inhibitor及阴性对照转染至THP1细胞,实时荧光定量PCR及Western blotting检测NLRP3和半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(caspase1)的表达水平.结果显示,试验成功构建含有NLRP3-3'UTR的野生型及突变型双荧光素酶报告载体;has-miR-5196-3p mimics极显著降低pmirGLO-NLRP3-3'UTR-wt的相对荧光素酶活性(P＜0.01);布鲁氏菌侵染THP1细胞后,NLRP3炎症小体被激活,而has-miR-5196-3p 无明显变化(P＞0.05);has-miR-5196-3p mimics 能显著抑制 NLRP3的表达(P＜0.05),而 has-miR-5196-3p inhibitor则相反.结果表明,miRNA分子has-miR-5196-3p可与NLRP3-3'UTR结合并抑制其表达,布鲁氏菌侵染THP1细胞过程中通过has-miR-5196-3p靶向负调节NLRP3炎症小体的表达及炎症的发生.