病毒样颗粒内标在荧光定量RT-PCR检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒方法中的应用

摘要

为建立对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(H-PRRSV)快速准确的检测方法,本试验构建兽医临床用病毒样颗粒内标表达载体,制备检测H-PRRSV的病毒样颗粒内标.在H-PRRSV Nsp2基因保守区域设计了1对特异性引物和1个TaqMan荧光探针,通过对反应体系和扩增条件的优化,建立了检测H-PRRSV的荧光定量RT-PCR检测方法;将MS2噬菌体的成熟酶蛋白和衣壳蛋白基因序列定向插入pET-32a载体的相应位置,在载体下游插入人工合成包含引物和探针的内标基因序列,采用双酶切和PCR鉴定阳性质粒,将阳性质粒转化大肠杆菌BL21工程菌,IPTG诱导表达,制备了病毒样颗粒内标.试验结果表明,所建立的方法特异性强,灵敏度高,对8份已知病毒的检测结果显示特异性为100％,检测滴度为1 TCID5o/mL病毒液,对42份临床样本的检测结果与农业部备案试剂盒检测结果完全一致,体现了较好的实用性.