GoldenBraid酶切连接反应体系的优化

摘要

旨在获得更为高效稳定的GoldenBraid(GB)酶切连接组装反应体系.通过优化GB反应中酶切时间、缓冲体系、限制性内切酶和底物配伍来提高有效克隆的效率,确定最佳反应体系.结果 显示,4 min酶切时间,1μL FastDigest Buffer(10×)缓冲体系,1 mmol/L ATP,0.5μL FastDigest Esp3I或FastDigest Eco31I,元件供体载体与受体载体的摩尔比3:1时,有效克隆比例接近99％,是优化前(BsmBI 8％、BsaI 23％)的4倍以上,此时酶切连接效率接近100％.与原始方案相比,通过体系的优化,可以在更少内切酶用量(原方案为1μL)的情况下,显著提高有效克隆比例,表明本方法能提高GB系统的酶切连接效率和实用性.