氧化还原对NDPK-A及突变体磷酸转移酶活性的影响

摘要

对核苷二磷酸激酶A( NDPK-A)及其4种半胱氨酸突变体进行诱导表达及纯化,测定它们在氧化还原务件及正常条件下的磷酸转移酶活性,研究氧化还原及二硫键异构对NDPK-A及突变体活性的影响.将实验室之前构建成功的野生型NDPK-A( PBV-NDPK-A)及4种突变型NDPK-A基因(PBV-NDPK-A C4S,PBV-NDPK-A C109S,PBV-NDPK-A C 145S,PBV-NDPK-A C4/109/145S)在大肠杆菌中高效表达；以DEAE-sepharose Fast Flow离子交换层析与Cibacron Blue 3GA Sepharose CL-4B 亲和层析技术纯化目的蛋白；HPLC法测定比较野生型NDPK-A及突变体在氧化还原和正常环境下磷酸转移酶活性.结果显示,NDPK-A及突变体在大肠杆菌中高效表达；经纯化分别获得了均一的NDPK-A蛋白及突变体蛋白,纯度均达到98％；在还原环境下NDPK-A及突变体的磷酸转移酶活性均高于正常环境下的活性,但是在氧化环境下的磷酸转移酶活性明显低于正常环境下.氧化还原环境对NDPK-A结构异构及磷酸转移酶活性有一定的影响,提示氧化还原环境可能调控NDPK-A二硫键的形成,影响蛋白的聚集状态,从而影响蛋白的磷酸转移酶活性,并且NDPK-A结构中可能有更为复杂的氧化还原调控酶活性机制.