短发夹状RNA抑制GCS基因在人乳腺癌细胞的表达及逆转其多药耐药

摘要

目的构建葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)基因的短发夹状RNA(shRNA),观察其对人耐药乳腺癌细胞GCS表达的抑制及多药耐药的逆转作用.方法设计2对GCS基因编码的反向重复序列,中间间隔6个nt,体外合成并克隆至载体pSUPER.转染乳腺癌细胞,Western blot和免疫细胞化学方法测定GCS表达.Western blot、比色法检测细胞内caspase-3的表达,流式细胞仪分析细胞凋亡率.四氮唑盐(MTT)法检测半数细胞抑制浓度.结果酶切和DNA测序证实重组质粒构建成功.转染后GCS蛋白含量分别下降80%和82%,GCS表达阳性率降低为18.1%和16.7%.caspase-3表达和活性均显著增强,细胞凋亡率明显增加,细胞对化疗药物耐药性有明显下降.结论shRNA可有效抑制人耐药乳腺癌细胞中GCS表达,并可提高其对多种化疗药物的敏感性.