Let-7a靶向抑制Ewing肉瘤中CDK6的表达

摘要

目的 研究抑癌microRNA(Let-7a)在Ewing肉瘤细胞系中的靶基因.方法 用Northern blot分析细胞系中Let-7a的表达量;构建pMIR-reporter-CDK6野生型(CDK6_WT)或突变型(CDK6_MUT)及阳性对照(Let-7a_PC)质粒;体外合成的寡核苷酸(Let-7a_mimic)转染Ewing肉瘤细胞系SK-ES-1,用real time PCR检测Let-7a的表达;通过生物信息软件分析、双荧光素酶报告实验和Western blot寻找并确定Let-7a的靶基因.结果 Let-7a在Ewing肉瘤细胞系中系低表达,以MSCs为参照,SK-ES-1 Let-7a/U6 snRNA灰度值最高为:0.193±0.024(P＜0.05);双酶切和DNA测序鉴定质粒构建成功;在SK-ES-1细胞中成功过表达Let-7a(P＜0.01);野生型CDK6(CDK6_WT)荧光素酶表达水平与对照组和突变型CDK6(CDK6_MUT)相比明显下降(P＜0.05);在SK-ES-1细胞系中过表达Let-7a抑制了CDK-6 mRNA和蛋白质的表达.结论 确定了抑癌micmRNA(Let-7a)在Ewing肉瘤细胞系中靶基因,为进一步实验奠定了基础.