虾肝肠胞虫TaqMan-MGB荧光定量PCR检测技术的建立

摘要

近年来,虾肝肠胞虫病(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)严重威胁虾类健康成长,为了精准快速检测该病原,本文选取虾肝肠胞虫保守基因片段PTP2为靶序列,设计并合成TaqMan-MGB实时荧光定量PCR引物及探针,同时将扩增获得的特异PCR目的基因片段克隆到pMD18-T载体,得到重组质粒标准品。通过优化反应条件,建立了EHP TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行了灵敏度、特异性和重复性分析。试验结果证明,该反应体系的最佳退火温度为56℃,上下游引物浓度为10 μmol/L,探针浓度为5 μmol/L;灵敏度检测限最低可达到2.7 ×102拷贝/反应。特异性试验表明,该方法与WSSV、IHHNV和SHIV这3种水生动物病原无交叉反应,只与目标病原有特异性扩增。重复性试验显示,该方法具备良好的重复性及稳定性。采用研究建立的检测方法,初步应用在了实际临床样品检测中,结果显示,该方法与TaqMan荧光定量PCR方法具有类似的敏感性。以上结果显示,研究建立的EHP的TaqMan-MGB实时荧光定量PCR方法具有较高的敏感性、良好的特异性及重复性,适用于虾类及产品中肝肠胞虫的检测与监测。