猪流行性腹泻病毒血清学监测和监视方法酶联免疫吸附测定(ELISA)的开发与验证

摘要

猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDv)是冠状病毒属的成员之一,会引起哺乳仔猪急性发作严重的腹泻和呕吐,从而导致其大批死亡。PEDv最初发现于欧洲,现今已传播到亚洲。其在美国的首次出现时间为2013年5月,并且至2013年7月中旬,15个州确定存在PEDv。因此,美国急需快速、高通量的诊断检测方法,以进行血清学监测和监视。我们旨在设计可供诊断室使用的PEDv的ELISA测定分析方法,以检测猪血清、口液和粪便中PEDv抗体。研究人员已完成了美国多个PEDv分离株的病毒颗粒(N)和纤突蛋白(spike protein)1区(S1)和2区(S2)的测序,发现它们的同源性在99%以上。因此,任意分离株的重组蛋白都可以代表美国的PEDv分离株,且在酶联免疫吸附测定中应该能产生交叉反应。为了净化PEDv蛋白,笔者设计了PCR引物,以扩增N、S1和S2。随后,扩增的基因克隆到pET-25b和pMAL-p5X载体中,以进行细菌表达。两种载体将用于提高获得大量高纯度蛋白质的可能性。6X-his标签用于金属亲合蛋白(pET-25b)的纯化,而麦芽糖结合蛋白融合通过淀粉色谱分析法用于蛋白质纯化(pMAL-p5X)。纯合蛋白一旦获得,将要开发的直接ELISA法用于检测猪血清中PEDv抗体。血清检测中获得最佳ELISA结果的蛋白或蛋白融合物将进一步优化,以用于粪便和口液样本中病毒抗体的检测。