根癌农杆菌介导的尖孢镰刀菌遗传转化体系构建

摘要

【背景和目的】尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)可引起烟草镰刀菌根腐病(Fusarium root rot of tobacco),为明确病原菌致病相关基因。【方法】以烟草强致病性尖孢镰刀菌菌株B-9-1的分生孢子为受体,利用携带潮霉素B(hygromycin B,hyg)质粒的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化,获得能够稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的尖孢镰刀菌转化菌株,构建烟草尖孢镰刀菌遗传转化体系。【结果】(1)尖孢镰刀菌的最优转化体系为:潮霉素B最适质量浓度50μg/mL,在25℃条件下,以1 cm宽的条形硝酸纤维膜为载体,将携带有pCAM-GFP-hyg质粒的根癌农杆菌摇菌培养至OD600=0.7,与震荡培养24 h获得的浓度为106个/mL的尖孢镰刀菌分生孢子悬浮液在含有200μmol/L乙酰丁香酮的共培养基上共培养48 h。(2)转化子继代培养、PCR检测和荧光显微观察结果表明外源GFP基因成功整合到烟草尖孢镰刀菌基因组中并可以进行稳定遗传表达。(3)Sourthern blot分析结果进一步证明T-DNA成功整合到尖孢镰刀菌基因组中,且60%以上为单拷贝插入。【结论】本研究成功构建了根癌农杆菌介导的烟草尖孢镰刀菌遗传转化体系,为烟草尖孢镰刀菌基因功能及病原菌的致病机制研究提供基础。