一种高R-选择性水解R,S-甲霜灵的酯酶基因的克隆表达及表征

摘要

[目的]将一种可以高选择性水解R-甲霜灵的新脂酶基因,在大肠杆菌中进行克隆和表达,并研究重组脂酶的性质.[方法]根据已知的目标酯酶N端10个氨基酸序列,在已测序的Albibacters sp.zjut528基因组中找到相匹配的一个酯酶基因,它全长969 bp,编码322个氨基酸,将该基因命名为RMest.通过引物扩增得到该基因的DNA片段,将它与表达载体pET-28a(+)连接后,转化大肠杆菌BL21Gold(DE3),构建重组菌,IPTG诱导表达该酯酶,并用Ni2+亲和层析介质进行纯化.[结果]在重组菌RMest-pET-28a(+)-E.coli BL21 Gold (DE3)中成功表达了重组酯酶RMesterase,大小约为46 kDa.用胞内重组酶液催化水解R,S-甲霜灵,底物浓度10 g/L,反应6h,底物转化率为49.8％,产物(甲霜灵酸)的eep为99.3％,对底物的对映体R-构型具有专一(选择)性.该酶最适温度和pH分别为40℃和pH 9.0.该酶的活性受到产物甲醇的抑制.通过Blast+在Uniprot KB数据库中搜寻与酯酶RMest同源的蛋白,采用邻近法构建该酶的蛋白系统发育树,结果显示它与某些Lysophospholipase、AB hydrolase-1 domain-containing protein和Esterase的同源性最高,但是与它们均存在较大的进化距离,表明该酶是一种相对独立进化的新酯酶.[结论]在大肠杆菌中成功克隆和表达了一种新的脂酶基因RMest,重组酯酶RMesterase可以高手性选择性水解R,S-甲霜灵生成R-甲霜灵酸.