操纵茶树类黄酮3'-羟基化酶生物合成B环-3',4'-二羟基黄酮类化合物

摘要

[目的]操纵茶树类黄酮3’-羟基化酶,生物合成B环-3',4'-二羟基黄酮类化合物圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素.[方法]构建了4个茶树类黄酮3’-羟基化酶基因(CsF3'H)和拟南芥的P450还原酶基因(ATR)融合表达质粒:SUMO-CsF3'H[7-517]::ATRl [49-688]3 AA、SUMO-CsF3'H[28-517]::ATRl [49-688]3 AA、SUMO-CsF3'H[7-517]::ATR2 [75-711]3 AA和SUMO-CsF3'H[28-517]::ATR2[75-711]3 AA,分别转化大肠杆菌菌株TOP10、DH5α和BL21,获得12个转化菌株S1-S12;构建了茶树类黄酮3'-羟基化酶基因CsF3'H表达质粒pYES-Dest52-CsF3'H,转化酵母菌株WAT 11,得到转化菌株S13;构建了茶树类黄酮3'-羟基化酶基因CsF3H表达质粒pES-URA-CsF3'H,及茶树黄烷酮3-羟基化酶基因CsF3H与拟南芥黄酮醇合成酶基因AtFLS的融合表达质粒pES-HIS-CsF3H::AtFLS 9AA,二者共转化酵母菌株WAT 11,获得转化菌株S14.[结果]转化SUMO-CsF3'H[28-517]::ATR1[49-688]3 AA质粒的TOP10菌株S6在25C条件下发酵,转化效率最高,能将1000 μmol/L柚皮素、二氢山奈酚和山奈酚,分别转化生成287.93 μmol/L圣草酚、131.76 pmol/L二氢槲皮素和188.62 μmol/L槲皮素.发酵菌株S13能分别将1000 μmol/L柚皮素、二氢山奈酚和山奈酚,最多能转化生成734.32 μmol/L圣草酚、446.07 μmol/L二氢槲皮素和594.64 μmol/L槲皮素.喂食S14发酵菌株5 mmol/L的底物柚皮素,在发酵36-48 h中,最多能生成1412.16 μmol/L圣草酚、490.25 μmol/L山奈酚、445.75 μmol/L槲皮素、66.75 μmol/L二氢槲皮素和73.50 μmol/L二氢山奈酚.[结论]本研究首次将茶树类黄酮3'-羟基化酶基因应用于B环-3',4'-二羟基黄酮类化合物圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素的生物合成.