布鲁氏菌BP26基因标记疫苗株的构建及鉴别PCR方法的建立

摘要

【目的】由于现有的减毒活疫苗仍存在较强的毒力,因抗原与毒株的差异不大而很难区分疫苗免疫和自然感染等缺点,限制了现有布鲁氏菌减毒活疫苗的广泛应用。本文拟对布鲁氏菌的减毒活疫苗株M5进行遗传改造,克服这些缺点。【方法】本研究利用同源重组的方法,用卡那抗性基因替换了布鲁氏菌减毒疫苗株M5的BP26基因,得到了新的标记疫苗株M5ΔBP26。分别用标记疫苗株和野生株侵染巨噬细胞和感染小鼠,比较分析标记株在细胞内和小鼠体内的存活能力。根据种特异性保守基因dnaK和缺失的BP26基因设计引物,建立双重PCR,用于区分标记株与野生株。【结果】成功构建了BP26基因标记疫苗株,细胞实验和动物实验结果表明,标记株仍能在胞内和小鼠内存活,具备作为减毒活疫苗的特性。小鼠实验结果显示,感染后两周野生株的细菌数为102.9,而突变株为101.1(P<0.01),至第3周野生株的细菌数为102.2,而突变株未能检出,表明与原疫苗株相比,标记株的感染力进一步减弱。根据DNA序列的差异,建立了能够区分标记疫苗株与野生株的双重PCR方法,标记株因只能扩增出一条带而能与野生株和毒株相区分,从而可以区分自然感染和疫苗免疫。【结论】基因标记疫苗株的构建及鉴别PCR方法的建立,为布鲁氏菌疫苗的进一步研发奠定了基础。