海伦脑炎微孢子虫分泌蛋白EhPTP4对宿主内质网蛋白降解通路的调控作用（英文）全文替换

摘要

【目的】微孢子虫是一类专性细胞内寄生的真核病原微生物,能够感染人类和几乎所有的动物。本课题以海伦脑炎微孢子虫（Encephalitozoon hellem）为研究对象,探讨其极管蛋白4（EhPTP4）作为一个潜在的分泌性毒力因子在宿主细胞内的定位和功能。【方法】制备EhPTP4的鼠源多克隆抗体,利用间接免疫荧光分析和Western blotting确定EhPTP4在感染细胞中的亚细胞定位;基于序列特征,在HEK293细胞中转染野生型和突变体EhPTP4,分析该蛋白的定位及其对病原增殖的作用;利用RNA-seq对转染EhPTP4的HEK293细胞进行转录组测序,分析EhPTP4引起的宿主基因表达和通路的变化;进一步通过RNAi和细胞转染分析差异表达基因的调控作用,利用RT-qPCR和Western blotting验证调控效果。【结果】EhPTP4的N端具有信号肽,C端具有富含组氨酸的结构域（HRD）和核定位信号序列（NLS）。蛋白定位分析显示,在感染和转染细胞中,EhPTP4均被分泌至宿主细胞核内。在HEK293细胞中过表达EhPTP4显著促进了病原的增殖。RNA-seq和蛋白泛素化分析发现,EhPTP4显著上调了宿主内质网蛋白降解通路（endoplasmic reticulum-associated degradation,ERAD）关键基因（PDIA4、HERP、HSPA5和Derlin3）的表达和宿主蛋白的泛素化修饰,表明EhPTP4具有调控宿主内质网蛋白降解的功能。在HEK293细胞中过表达PDIA4发现,蛋白泛素化修饰明显上调,而RNA干扰PDIA4则导致HERP基因表达下调,表明PDIA4在病原调控宿主ERAD过程中发挥着关键作用。进而,对EhPTP4的HRD进行了缺失突变(EhPTP4ΔHRD)并转染细胞,发现此缺失突变体并未引起PDIA4和HERP的表达发生显著上调,表明HRD对EhPTP4的毒力功能起到关键作用。【结论】首次报道了微孢子虫利用分泌蛋白调控宿主的ERAD和蛋白泛素化,为深入解析该病原的致病机理提供了重要参考。