圆形碘泡虫孢子的分离纯化与裂解

摘要

@@近年来，粘孢子虫的分子生物学及免疫学逐步发展［1，2］，在很多研究中都需以纯净的孢子为材料，因此如何从鱼体分离出纯净的孢子就显得格外重要。另一方面，粘孢子虫的孢子具坚韧的壳瓣，在提取虫体基因组DNA时，必须先使其裂解，方法主要有常规裂解液裂解法、热裂解法、超声破碎法、液氮冷冻研磨法等几种方法，本文对这几种方法进行比较后认为：液氮冷冻研磨法既可使多数虫体裂解，对DNA的破坏又比较小，是较为行之有效的方法。rnrn1 材料和方法rn1.1 材料病鱼系武汉市鄂州收集的冻存标本，其体表具有大量圆形碘泡虫(Myxobolus rotundus Nemeczek,1911)孢囊。rn1.2 粗孢子的分离用镊子小心取下孢囊，于研钵中磨碎，用含2%盐酸(v/v)的2%胰蛋白酶(w/v)消化1～3h，然后经双层纱布过滤，滤液1000r/min离心10min，弃上清。rn1.3 孢子的提纯沉淀加适量蒸馏水重悬，并加等量乙醚，剧烈振荡后200r/min低速离心，吸出上层乙醚及中间层，下层水相1000r/min，离心10min，沉淀用0.1mol/L pH8.0的PBS洗三次。rn1.4 常规裂解法将孢子(2×106)重悬于500μL裂解液(100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris pH7.6，10mmol/L EDTA,0.2%SDS，0.2mg/mL蛋白酶K)，37℃温育16h。