半夏PtPAL基因的克隆、表达与酶动力学分析

摘要

本研究以半夏为研究对象,基于其转录组数据克隆获得1个苯丙氨酸解氨酶基因,命名为PtPAL,通过DNAMAN、MEGA等生物信息学软件进行序列结构与系统进化分析表明,该基因核酸序列长度为2289 bp,编码762个氨基酸,终止密码子为TAA,PtPAL与单子叶植物百合PAL相似度达78％,具有PAL-HAL、PLN02457、phe_am_lyase、Lyase_aromatic及HutH结构域,属于苯丙氨酸解氨酶家族成员(Lyase_I_like Superfamily).半夏PtPAL与单子叶植物百合、菠萝和油棕亲缘关系较近,归于单子叶植物.采用实时荧光定量PCR分析PtPAL在不同组织间的表达情况表明,PtPAL基因在叶中表达量最高,其次是块茎和根,花中表达量最低.通过对半夏PtPAL基因进行功能表达分析发现,PtPAL重组蛋白可以高效催化L-Phe生成t-CA,且催化反应最适pH与温度分别为9.0、70°C;PtPAL的Km、Vmax、Kcat和Kcat/Km分别为0.89 mmol L-1、63.96 nKat mg-1、6.56 s-1和7.37×103 s-1 M-1.进一步探究金属离子对PtPAL酶活性的影响表明,Ba2+显著增强了PtPAL酶活性,Mn2+、Co2+、Cu2+及Zn2+抑制了PtPAL酶活性.本研究为进一步研究PtPAL的功能特点及半夏苯丙胺类生物碱代谢途径奠定基础.