基于毛细管电泳的7种猪源性疫病的多重PCR检测方法的建立

摘要

为建立一种基于毛细管电泳技术,可同时高效地检测7种常见猪源性疫病(猪链球菌、猪瘟病毒、日本脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、副猪嗜血杆菌、猪轮状病毒、沙门氏菌)的高通量快速检测方法,本研究将多重PCR与毛细管电泳相结合,针对各毒株基因保守序列分别设计7对特异性引物,在每条引物的5'端加上通用引物标签序列,构成特异性嵌合引物.进行梯度PCR扩增以优化退火温度,使用正交试验以进行特异性嵌合引物浓度的优化.取107～10-1 copies·μL-1浓度梯度的标准品进行检测,以评价该方法的灵敏性.选取7种病原的DNA或cDNA,进行随机分组作为模板进行扩增,检测交叉反应性.以猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、构建的非洲猪瘟质粒、大肠埃希菌等其他重要病原的DNA或cDNA进行扩增,评价该方法的特异性.使用梯度稀释的7重混合样品进行扩增,每个稀释度进行3次扩增,以评价该方法的重复性.结果显示:该方法的最优退火温度为58.3°C,对7种病原进行同时检出的检测限度为103 copies·μL-1,各种对照样品均出现了特异性峰值,并且所有的阴性对照样品均未扩增,也未出现交叉反应性,重复试验之间数据差异变化微小,63份临床样品检测结果与国标或行业检测标准的检测结果完全一致.以上实验结果显示,所建立的方法具有高通量、特异性好、灵敏度高、方便快速等优点,可用于临床鉴别诊断和流行病学调查,有较高的临床应用价值.