大豆GmWRKY50的抗体制备及其蛋白水平表达分析

摘要

为阐明GmWRKY50转录因子在大豆与大豆花叶病毒(SMV)互作过程中的作用机制,以大豆叶片的RNA为模板,利用PCR技术克隆了GmWRKY50基因的编码区全长,利用MEGA 7.0软件对不同物种中GmWRKY50的相似氨基酸序列进行比对并进行系统进化树分析,通过原核表达技术,构建pColdⅡ-GmWRKY50重组质粒,转化大肠杆菌BL21后,利用IPTG对带有His标签的GmWRKY50重组蛋白进行诱导,经Ni-NTA柱对重组蛋白进行纯化,收集纯化后的重组蛋白进行多克隆抗体的制备,通过Western Blotting检测GmWRKY50在SMV侵染前后的表达水平变化.结果表明,GmWRKY50基因的CDS全长为495 bp,编码165个氨基酸,在N端含有一个WRKY结构域,属于WRKY DNA-binding结构域蛋白.序列比对及系统进化树分析表明,大豆GmWRKY50与拟南芥AtWRKY50同源关系最近;IPTG浓度为0.5 mmol/L,诱导时间为4 h,重组蛋白的诱导效果良好,利用镍离子亲和纯化获得与His蛋白标签融合的目的蛋白,具有较高的可溶性.以融合蛋白为抗原制备的多克隆抗体可以特异性结合GmWRKY50蛋白,GmWRKY50蛋白在不亲和组合中受SMV侵染诱导而上调表达,为进一步研究转录因子GmWRKY50在大豆抵御SMV侵染过程中的功能奠定了基础.