常用抗生素在大鼠成骨细胞内的蓄积及相关有机离子转运体mRNA的初步研究

摘要

牙周组织的健康对于牙齿的保存及种植修复均有重要意义。炎症、感染会造成牙槽骨吸收,并最终导致牙齿松动、脱落/种植体骨结合失败。抗生素是预防和治疗感染的重要方法。在口腔临床工作中,抗生素的全身或局部应用已经成为治疗牙周炎和种植体周围炎的重要辅助手段。细胞内抗生素的蓄积可祛除侵入细胞的致病菌,提高牙周基础治疗效果,防止感染反复发作。刘洪臣提出种植体/根管给药系统的设想,希望药物经根周组织或种植体周骨组织转运到达局部乃至全身。牙龈上皮细胞,牙龈及牙周膜成纤维细胞已被证明可转运抗生素,但成骨细胞转运抗生素的特点及其机制尚无深入研究。细胞内药物含量与细胞的转运载体密切相关。因此,本研究以大鼠下颌骨成骨细胞为研究对象,对成骨细胞是否可以摄取抗生素、摄取过程及特点以及何种转运蛋白参与了摄取等问题进行研究,从而了解临床常用抗生素在成骨细胞的转运和分布特点,为临床合理化选择抗生素提供理论基础,为人工种植牙/根管给药系统提供实验依据。
　　 本试验通过对HPLC系统特异性,稳定性,精密度,回收率和线形范围的考察,建立了准确、可信的HPLC检测方法。之后,采取改良组织块贴壁法,取4-6周及新生SD大鼠下颌骨成骨细胞进行原代培养,并做碱性磷酸酶(ALP)染色、骨钙素(OC)免疫荧光染色及钙结节染色鉴定,结果以上三种染色均显示阳性,说明本试验中采用的原代培养成骨细胞的方法可靠,可获得大量大鼠下颌骨成骨细胞。将甲硝唑、替硝唑、诺氟沙星、盐酸四环素、盐酸米诺环素、头孢噻肟钠、罗红霉素、盐酸林可霉素8种临床常用抗生素,分别与成年大鼠下颌骨成骨细胞(MRMOB)、新生大鼠下颌骨成骨细胞(NRMOB)、小鼠成骨样细胞系MC3T3-E1细胞共孵育后,提取细胞并超声破碎获得细胞内液体,应用高效液相色谱法(HPLC)测定细胞内抗生素浓度。结果:①甲硝唑、替硝唑、诺氟沙星、盐酸四环素、盐酸米诺环素、头孢噻肟钠与成骨细胞共孵育后,均可在成骨细胞内检出,细胞内药物浓度最初随时间增加而增加,到10min时基本稳定。细胞内未检测到罗红霉素和盐酸林可霉素。②细胞内药物浓度和细胞内外药物浓度比因抗生素的种类不同而不同。盐酸米诺环素最易于在大鼠成骨细胞内蓄积(CI/CE=0.3725),其次为盐酸四环素(0.065),之后依次为诺氟沙星(0.053),替硝唑(0.019),甲硝唑(0.0165),头胞噻肟钠(0.0067)。③对于同一种抗生素,细胞种类不同,其胞内药物蓄积量也不相同。MC3T3-E1细胞胞内所有抗生素含量均不多于其它两种细胞；新生大鼠下颌骨成骨细胞内头胞噻肟钠的含量明显多于MC3T3-E1细胞；成年大鼠下颌骨成骨细胞对盐酸四环素和盐酸米诺环素的摄取明显多于新生大鼠下颌骨成骨细胞；对于甲硝唑,替硝唑和诺氟沙星,这两种细胞的摄取量没有明显差异。无论是新生大鼠还是成年大鼠下颌骨成骨细胞中,盐酸米诺环素的胞内浓度都远远高于其他抗生素。我们进而应用实时RT-PCR技术对MRMObs上转运体mRNA的表达进行了检测,并初步判定了参与盐酸米诺环素转运的转运体。结果表明成骨细胞可表达OCT1,OAT2、OAT3,OATP2,OCTN1、OCTN2和OCTN3,其中,OCTN1,OCTN2,OCTN3和OCT1参与了对米诺环素的转运。
　　 综上所述,成骨细胞内有抗生素的蓄积,蓄积量因抗生素种类、年龄、种属差异而不同；盐酸米诺环素可在成骨细胞内大量蓄积,在胞内达到较高的药物浓度,利于杀灭细胞内细菌；成年大鼠下颌骨成骨细胞表达多种转运体,包括OCT1,OAT2、OAT3,OATP2,OCTN1、OCTN2、OCTN3,其中OCT1,OCTN1,OCTN2参与了米诺环素的转运。这一结果验证了种植体/根管给药系统的可行性,也提示我们局部给与抗生素应考虑其胞内蓄积量,根据临床需要选择用药。