雌激素对淋巴细胞增殖的影响及其诱导抗原特异性CD4CD25调节性T细胞的研究

摘要

第一部分
　　 目的：
　　 以观察不同剂量雌激素对反应淋巴细胞增殖的影响为出发点，探讨雌激素在小鼠淋巴细胞单向混合培养体系中的作用；探讨雌激素浓度与反应细胞中CD4+CD25+调节性T细胞亚群的关系；探讨高浓度雌激素引起免疫抑制的可能机制。
　　 方法：
　　 (1)在小鼠淋巴细胞单向混合培养体系中加入梯度浓度雌激素(10-5M～10-9 M)，采用AlamarBlueM法检测雌激素浓度对体系中反应细胞增殖的影响；采用流式细胞术检测雌激素浓度对反应细胞中CD4+CD25+调节性T细胞亚群变化的影响；采用半定量RT-PCR法检测雌激素浓度对反应细胞FoxP3 mRNA表达的影响。
　　 (2)采用流式细胞术检测高浓度雌激素(10-7M)及高浓度雌激素α受体激动剂(10-7 M)刺激下，经CD3抗体及CD28抗体活化后的反应细胞中CD4+CD25+T细胞亚群变化及其增殖情况。
　　 (3)在CD3抗体及CD28抗体活化的淋巴细胞增殖体系中加入高浓度雌激素(10-7 M)，采用半定量RT-PCR法检测反应细胞TNF-α、IL-10、TGF-βmRNA水平的变化。
　　 结果：
　　 (1)只有生理浓度的雌激素可以促进反应细胞的增值，随着雌激素浓度的升高淋巴细胞增殖比率逐渐降低，且存在剂量依赖性。反应细胞CD4+CD25+T细胞亚群的比例变化与FoxP3 mRNA表达的变化一致，均随着雌激素浓度的升高表达先升高后降低，在妊娠浓度雌激素(10-7M)时达到高峰。
　　 (2)高浓度雌激素(10-7M)及雌激素α受体激动剂均可抑制淋巴细胞的增值，上调CD4+CD25+T细胞亚群的比例，但雌激素作用效果更强。
　　 (3)高浓度雌激素可以下调反应细胞TNF-αmRNA表达，但对IL-10、TGF-βmRNA的表达具有促进作用。
　　 结论：
　　 (1)生理浓度的雌激素可以促进淋巴细胞的增值，但随着雌激素浓度的增高细胞增殖逐渐被抑制。
　　 (2)高浓度的雌激素及雌激素α受体激动剂均可以促进反应细胞FoxP3的表达，诱导CD4+CD25+调节性T细胞的产生，进而起到抑制反应细胞增殖的作用，但雌激素的效果更强。
　　 (3)高浓度雌激素通过使反应体系中Th1类细胞因子向Th2类细胞因子偏移，破坏了细胞因子间的动态平衡，进而对免疫反应起到抑制作用。
　　 第二部分
　　 目的：
　　 探讨妊娠浓度雌激素经体内、体外两种方式诱导产生CD4+CD25+调节性T细胞的供体抗原特异性免疫调节功能，并分析其可能机制。
　　 方法：
　　 (1)分离Balb/c小鼠脾淋巴细胞，经丝裂霉素处理后标记荧光染料CFSE，后与C57小鼠脾淋巴细胞在高浓度E2(终浓度为10-7)的刺激下于37℃、5％CO2培养箱中培养3天后，应用流式细胞术检测CFSE阴性细胞(即C57小鼠脾淋巴细胞)CD4+CD25+T细胞亚群的比率变化，同时分选该群细胞。
　　 (2)在C57孕鼠尾静脉注射经丝裂霉素处理后的Balb/c小鼠脾淋巴细胞悬液(106个，200μl)，连续注射5天后，分离该孕鼠脾淋巴细胞悬液，应用流式细胞术检测CD4+CD25+T细胞亚群的比率变化，同时分选该群细胞。
　　 (3)将妊娠浓度雌激素诱导产生的CD4+CD25+T细胞作为调节细胞，再次与初次接触的抗原提呈细胞(BALB/c)及第三方抗原提呈细胞(C3H/He)共培养，观察其对反应细胞(C57BL/6)增殖的影响。
　　 (4)将妊娠浓度雌激素诱导产生的CD4+CD25+T细胞通过尾静脉输入到小鼠皮肤移植模型中，观察移植皮瓣的存活情况。
　　 结果：
　　 (1)妊娠浓度雌激素体外诱导和体内诱导均可使反应细胞CD4+CD25+T细胞亚群的表达比率上调，但以体外诱导效果更明显。体内诱导vs.体外诱导为(7.13±0.56)％vs.(12.13±1.76)％。
　　 (2)使用流式细胞术分选CD4+CD25+调节性T细胞，可以达到较高的纯度(>95％)。
　　 (3)妊娠浓度雌激素体外诱导产生的CD4+CD25+调节性T细胞具有供体抗原特异性特征，其对供者抗原刺激引起反应细胞增殖的抑制能力显著高于第三方抗原刺激引起的反应细胞增殖，增殖比率为(0.28±0.08) vs(0.59±0.16)，p<0.05。同时该群细胞可以显著延长父系移植皮瓣的存活时间。
　　 (4)孕鼠体内诱导产生的CD4+CD25+调节性T细胞具有供体抗原特异性特征，其对供者抗原刺激引起反应细胞增殖的抑制能力显著高于第三方抗原刺激引起的反应细胞增殖，增殖比率为(0.25±0.06)vs(0.61±0.11)，p<0.01。同时该群细胞也可以延长父系移植皮瓣的存活时间。
　　 结论：
　　 妊娠浓度雌激素诱导产生的CD4+CD25+调节性T细胞具有显著的供者抗原特异性免疫抑制功能，免疫抑制效果以雌激素体外诱导产生的CD4+CD25+调节性T细胞更显著。