截肢后大鼠肝肾损伤及其防护机制的研究

摘要

背景与目的：当机体受到创(烧)伤、手术、休克等打击时，会产生一系列防御反应，由于创伤本身及机体的过度性防御可能造成全身性的损伤，以心、脑、肾、肝等重要远隔脏器的损伤较重。肾脏为人体重要的排泄毒素、调节水电解质平衡及内分泌器官，肝脏为人体重要的合成和代谢器官，在应激条件下，均易受到损伤。临床上一旦出现急性肾功能衰竭，死亡率极高，但因其病理生理机制至今未明，早期诊断并采取有效的预防措施较为困难，而急性肝损害在严重创伤后也可出现，其机制也不明确。目前人们已逐渐认识到创伤是一种系统性疾病，从心脏手术、严重烧伤等动物模型和临床实验中，研究创伤后的远隔脏器的损伤；从血流动力学的改变、炎症反应、过氧化作用等方面研究其发生机制。本实验旨在建立截肢创伤模型来研究肝肾早期损伤的发生机制和防治措施，因而建立了截肢创伤后大鼠肾脏、肝脏的损伤模型，观察截肢后炎症、免疫、氧化因子等因素及病理学变化，并引入新型生物学指标：肾损伤分子-1检验其在该模型中对于急性肾损伤的预警作用。同时设立硫化氢(H2S)供体硫氢化钠(NaHS)、胱硫醚Y-裂解酶(CSE)抑制剂炔丙基甘氨酸(PPG)、免疫抑制剂他克莫司(Tacrolimus，FK-506)、醛固酮(ALD)抑制剂螺内酯干预组，进一步研究以上途径在截肢后肝肾损伤中的作用及其机制，以期为早期发现、诊断及有效干预创伤后肝肾损伤提供新方法和新措施。本实验分为两大部分：一、研究截肢后急性肝肾损伤发生的病理生理机制、早期预警指标及NaHS、PPG、FK506、螺内酯干预在急性肝肾损伤过程中的作用及其作用机制；二、研究创伤后肝肾线粒体的功能变化及NaHS、PPG、FK506、螺内酯的干预效果。
　　 方法：本实验应用大鼠左后肢截肢模型。第一部分实验分组：雄性Wistar大鼠91只，随机分为13组。正常对照组、手术后1h组、2h、4h、6h、12h、24h、48h、72h组及NaHS、PPG、FK-506、螺内酯干预组。干预组大鼠均在术后6小时处死(处死时间点由预实验结论得来)。每组7只。
　　 观察各组大鼠肝肾组织病理改变及血浆硫化氢(H2S)、髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)、血管紧张素II(AngII)、醛固酮(ALD)、一氧化氮(NO)、白介素-6(IL-6)、肾损伤分子-1(KIM-1)及肌酐(Cr)、尿素(Ur)水平的变化，同时检测各组大鼠肾组织肾损伤分子-1(KIM-1)、肝肾组织胱硫醚γ-裂解酶(CSE)活性、髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)、醛固酮(ALD)的含量及钙调神经磷酸酶(CnA-α)基因的表达。
　　 第二部分实验分组：雄性SD大鼠48只，分为：正常对照组、截肢后6h组、干预组(分为4组：分别给予NaHS、PPG、FK-506、螺内酯干预，截肢后6h处死)，每组8只。检测肝肾组织线粒体呼吸控制率(RCR)、膜电位、ATP酶活性的变化。
　　 结果：与正常对照组比较，截肢术后肝肾脏器出现不同程度组织充血水肿、细胞肿胀，截肢术后6h损伤最重，同时伴有血浆Cr、ALT、AST的下降。血浆及肾组织KIM-1在正常组合量极低，截肢后1小时呈持续升高，并明显早于血Cr的升高。截肢后大鼠血浆MPO、MDA、IL-6、AngII浓度呈现升高趋势，血浆H2S、NO浓度在截肢后下降。肝肾组织中MPO、MDA含量在截肢后出现升高与血浆基本相似，而CSE活性下降近似于血浆H2S浓度变化。血浆及肾组织ALD水平呈现双峰样改变，在截肢后1h即升高，随后降低，截肢后6h达最低值，然后开始升高。CAn-α基因的表达在截肢后肝肾组织中均呈现升高趋势。
　　 与截肢后6h比较，NaHS干预后血浆Cr、NO、ALD、AngII、MPO、H2S显著升高，血浆Ur、ALT，AST无明显变化，血浆MDA、KIM-1、IL-6显著降低。肾组织病理性损伤减轻，且MDA、MPO、KIM-1水平也显著降低，而CSE活性、ALD含量、CaN基因的表达显著升高。肝组织病理性损伤减轻，且MDA、MPO水平也显著降低，而CSE活性、CaN基因的表达显著升高。
　　 PPG干预后各项指标的变化：血浆ALT、AST、NO、ALD、AngII、MPO、H2S、IL-6水平显著降低，而血浆Ur、MDA无明显变化。血浆Cr、KIM-1显著升高。肾组织病理性损伤略有加重，且MPO无显著变化，MDA含量、CaN基因的表达、KIM-1也显著升高，而CSE活性、ALD浓度显著降低。肝组织病理性损伤无明显加重，MDA、MPO水平无显著变化，CaN基因的表达显著升高，而CSE活性、显著降低。
　　 螺内酯干预后各项指标的变化：血浆ALD、AngII、MDA、MPO、IL-6显著降低，而血浆Cr、Ur、MDA无明显变化，血浆ALT、AST、NO、H2S、KIM-1显著升高。肾组织损伤有所减轻，但MDA无显著变化，CSE活性、ALD、KIM-1含量显著升高，而MPO、CaN基因的表达显著降低。肝组织充血、水肿及细胞损伤减轻，但CSE活性无显著变化，而MPO、MDA、CaN基因的表达显著降低。
　　 FK506干预后各组指标变化：血浆Cr、MDA、MPO、KIM-1、IL-6显著下降，而血浆Ur无明显变化，血浆ALT、AST、NO、ALD、AngII、H2S显著升高。肾组织病理性损伤减轻，且MDA、MPO、KIM-1水平及CaN基因的表达也显著降低，而CSE活性、ALD浓度显著升高。肝组织病理性损伤也有减轻，且MDA、MPO水平及CaN基因的表达也显著降低，CSE活性显著升高。
　　 截肢后大鼠肝肾组织线粒体呼吸控制率、膜电位、ATP酶活性均明显下降，给予NaHS、FK-506、螺内酯干预后有不同程度回升，PPG干预后以上指标出现不同程度升高或无明显变化。
　　 结论：截肢术可造成大鼠的急性肝肾损伤。肾损伤分子-1为较敏感、可靠的判断截肢术后急性肾损伤的生物学指标，可起到早期预警的作用。H2S/CSE体系参与了截肢术后肝肾脏器的损伤过程，NaHS可对损伤的肝肾组织起保护作用，PPG的应用可能进一步加重组织损伤。CaN与截肢后肝肾的损伤过程密切相关，使用FK506干预可对截肢后损伤的肾组织具有保护作用。ALD参与截肢创伤后肝肾急性损伤过程，螺内酯的适当应用可对截肢后损伤的肝肾组织起保护作用。肢术不但可造成大鼠肝肾线粒体结构的损伤，也可对其呼吸控制率、膜电位、ATP酶活性造成明显的损伤。NaHS、FK-506、螺内酯对截肢后受损的大鼠肝肾线粒体呼吸控制率、膜电位、ATP酶活性具有一定的保护作用。

目录

文摘

英文文摘

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声明

前言

第一部分 截肢创伤致大鼠肝肾损伤的机制及其防护的实验研究

一、材料与方法

二、结 果

四、结 论

第二部分 截肢创伤致大鼠肝肾损伤后线粒体的功能变化及其干预的实验研究

一、材料与方法

二、结 果

三、讨 论：

四、结 论

参考文献

附图

攻读学位期间发表文章及参与课题

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