肿瘤相关抗原P1A的诱导表达及其增强细胞毒T细胞杀伤恶性肿瘤的研究

摘要

当前，恶性肿瘤（包括恶性血液系统疾病）的发生率和死亡率正处于不断上升之中。尽管包括异基因干细胞移植等先进的医疗技术和治疗手段大大改善了恶性血液系统疾病患者的预后，但晚期和多次治疗后复发的患者预后仍然很差。因此探索新的治疗方法，已成为改善此类患者预后的迫切需要。
　　 恶性肿瘤的免疫治疗早已成为人们关注的焦点之一。在过去的十年中，免疫治疗在多种肿瘤治疗中都获得了令人注目的成就，这些治疗手段包括细胞因子治疗，局部免疫刺激，肿瘤疫苗和异基因干细胞移植后的全身淋巴细胞输注（DLI）等。然而，这些治疗方法获得部分成功的同时，却未能使大多数肿瘤患者实现真正意义的治愈，甚至连肿瘤部分控制或缩小的目标也未达到。其原因是肿瘤细胞的免疫逃避，或者是机体免疫细胞的无能。进一步的研究表明，这种令人失望的现象是因为肿瘤细胞缺乏有效的免疫源性从而导致机体的免疫细胞无法识别或抗原呈递细胞无法有效地递呈抗原。因此，如何增强肿瘤组织/细胞的抗原性，是肿瘤免疫研究领域一个殛待解决的首要问题。
　　 癌/睾丸抗原（Cancer/testis antigens CTAs）是一类在胚胎组织和滋养层细胞优势表达的抗原，并在大约40％的恶性肿瘤患者中存在，而在正常组织中几乎没有表达。表观遗传学研究表明，该类基因在肿瘤中的表达大多数情况下处于低水平或沉默状态，其原因是其该类基因启动子的异常甲基化造成的。由于睾丸等组织的免疫豁免特性和CTA抗原的分布特点，使得该类抗原成为近年来免疫治疗的重要靶点之一。我们的前期研究表明，P1A是一种重要鼠类CT抗原，在多种肿瘤细胞有异常分布。该基因的表达受甲基化调控，5-杂氮胞苷等药物处理可恢复其表达。鉴于上述背景，我们从下述几个方面进行研究，旨在增强肿瘤细胞的免疫源性，并通过有效的抗原呈递，进而有效刺激机体产生有效的抗肿瘤作用。
　　 一、用5-杂氮胞苷处理多种肿瘤细胞，并在5-杂氮胞苷处理前后对所处理肿瘤细胞进行P1A的DNA和mRNA检测，进而阐明5-杂氮胞苷对肿瘤细胞P1A表达的影响，筛选受甲基化调控、便于体外、体内免疫研究的肿瘤细胞株（本研究中T细胞淋巴瘤细胞系EL-4符合上述条件）。
　　 二、对P1A的抗原表位（多肽片段）进行人工合成，以此多肽片段刺激经细胞因子诱导成熟的树突状细胞（dendritic cells，DCs），而后以一定数量经多肽刺激的DCs多次免疫BALB/c小鼠，使之产生针对P1A多肽的特异性细胞毒T细胞（cytotoxic T cell，CTL）。
　　 三、以免疫磁珠法分离小鼠脾脏内的CTL，（CD90+T细胞），以流式细胞仪检测P1A特异性CTL对肿瘤细胞的体外杀伤效果；同时分离CD4+和CD8+，进一步探讨其各自在免疫杀伤中的作用。
　　 四、构建荷瘤动物模型，在一定的时机经尾静脉给予荷瘤小鼠注射经特异免疫刺激产生的细胞毒T细胞，并以生理盐水、无关肽刺激的细胞毒T细胞为对照，观察P1A特异性CTL对肿瘤组织生长的抑制作用。
　　 五、以CFSE为示踪剂，进一步检测了特异性CTL在荷瘤小鼠体内的归巢运动及分布，进一步探讨克服免疫逃逸的有效方法。
　　 六、通过对不同方法处理的肿瘤细胞进行流式检测，探讨CTL杀伤肿瘤细胞机制。
　　 结果发现，5-杂氮胞苷诱导癌/睾丸抗原P1A的表达存在明显的量效和时效关系。通过DC细胞的递呈，有效地刺激小鼠产生P1A特异性细胞毒T细胞，体外、体内均证实其对P1A恢复表达的肿瘤细胞或组织均有杀伤作用；我们同时还发现CD4+T细胞在特异性杀伤中起重要的作用，这种杀伤与癌/睾丸抗原的表达和识别密切相关。此外，我们对P1A特异性CTL杀伤的机制进行了初步探讨。

目录

文摘

英文文摘

前言

材料与方法

第一部分 实验材料

一、主要试剂

二、主要仪器设备

三、细胞株与实验动物

第二部分 实验方法

一、细胞培养

二、培养细胞体外去甲基化处理

三、DNA的分离、纯化及硫化处理

四、RNA提取及反转录多聚酶链反应（RT-PCR）

五、甲基化特异性多聚酶链反应（MSP）

六、树突状细胞的制备

七、P1A特异性细胞毒T细胞的制备

八、T细胞亚群的磁珠分选

九、P1A特异性CTL体外杀伤活性的凋亡检测法检测

十、小鼠P1A阳性动物模型的构建

十一、P1A特异性细胞毒T细胞杀伤效果的体内研究

十二、P1A特异性细胞毒T细胞在小鼠体内归巢检测

十三、Caspase凋亡检测

十四、统计学方法

实验结果

第一部分 癌/睾丸抗原基因P1A谤导表达和免疫刺激的体外研究

一、癌/睾丸抗原基因P1A的表达与启动子甲基化的关系

二、癌/睾丸基因P1A作为肿瘤相关抗原诱导机体特异性免疫

第二部分 P1A特异性细胞毒T细胞活性的体内研究

一、荷EL-4细胞BALB/c移植瘤动物模型的建立

二、P1A特异性CTL对荷瘤BABL/c移植瘤生长的抑制作用

第三部分 P1A特异性细胞毒T细胞的归巢和细胞毒效应的机制探讨

一、P1A特异性CTL在小鼠体内的归巢

二、P1A特异性CTL发挥细胞毒效应的机制探讨

讨论

参考文献

文献综述

参考文献

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