人胚胎干细胞定向诱导生成内皮祖细胞及内皮细胞促进肿瘤生长的作用研究及机制初探

摘要

近年来，内皮细胞（ECs）的研究与应用价值受到科学家的广泛关注，对内皮细胞或内皮祖细胞发育分化调控机制及其应用价值的研究日益拓展和深入。内皮祖细胞（EPCs）作为血管内皮的前体细胞，在一定的条件下可以增生并分化为血管内皮细胞，从而有望在很多临床治疗中扮演重要角色。但内皮祖细胞来源非常有限，其只占外周血单个核细胞的0.02-0.1％。人胚胎干细胞（hESCs）为目前最为重要的再生医学种子细胞之一，与其他干细胞相比具有更强的增殖能力、多能性及低免疫原性，由hESCs诱导分化为EPCs有望成为我们获得EPCs或者是内ECs的重要来源。但是，hESCs向ECs总体分化效率不高，如何获取足够数量的有功能的ECs仍是当前面临的最大挑战。除此之外，hESC体外向EPCs/ECs的分化亦为研究内皮细胞的生物学特性以及内皮细胞发育分化的调控机制提供了不可多得的模型。
　　 内皮细胞像一把双刃剑，不仅在再生医学中具有非常重要的价值，其本身的增殖又与异常血管发育、恶性肿瘤等多种疾病的发生与发展密切相关。目前，探讨血管内皮细胞在生理和病理状态下的增殖发育与功能发挥的调控机制，从而开展以血管内皮为靶标的治疗受到越来越多的关注，如VEGF在恶性肿瘤发生与发展中的作用日益明确，VEGF抗体的临床价值受到广泛肯定。研究表明，作为实体肿瘤显著生理学特征的低氧是VEGF重要诱导因素之一，而低氧的生物学作用无疑主要是通过低氧诱导转录因子（HIF）介导完成的。那么，HIF在血管内皮增殖及其生物学功能的发挥中扮演怎样的角色是值得关注的问题。HIF家族中最重要的一个成员是HIF-1，其活性主要与α亚基有关。内皮细胞中HIF-1α被抑制之后，肿瘤细胞的生长与浸润等生物学活性是否受到影响，如果是，HIF-1α又是通过怎样的机制发挥其作用的?对这些问题的回答无疑将有助于我们更好的理解血管内皮细胞对于肿瘤细胞的作用，为进一步以血管内皮细胞为靶点的肿瘤治疗提供新的策略。
　　 基于此，本课题的研究分为二部分完成：
　　 一.人胚胎干细胞定向诱导生成内皮祖细胞
　　 保持良好干性的hESCs经胶原酶消化后，与MEF共培养，利用4步程序性诱导方法使其向内皮祖细胞分化：含有BMP4（10ng/ml）的培养基培养4天→去除BMP4后培养6天→使用MiniMACS系统分选CD34+细胞→使用EGM-2培养基继续培养7-10天。对诱导分化后的细胞进行形态学、特异基因表达及功能等方面的系列检测，与此同时，对诱导分化后的细胞在EGM-2培养体系中继续扩增培养。
　　 结果表明：诱导后的细胞呈梭形，形态均一，生长稳定，原代及传代后的细胞RT-PCR法均能检测到内皮细胞相关基因CD31、CD34、VE-cad、KDR、vWF、eNOS及平滑肌相关基因α-SMA；免疫荧光染色表达CD31、VE-cad和VEGF；能够吞噬低密度脂蛋白，并在Matrigel基质胶上形成管腔样结构；更换为平滑肌细胞培养基后，细胞增宽，体积增大，α-SMA基因表达增强22倍，免疫荧光染色可检测到α-SMA蛋白。不同代数细胞基因表达差异不明显。说明hESCs可以有效的诱导为EPCs，EPCs具有内皮细胞和平滑肌细胞双向分化能力。
　　 二.内皮细胞促进肿瘤生长的作用研究及机制初探
　　 在本部分实验中，我们首先分离、培养并鉴定人脐静脉内皮细胞（HUVECs），进而明确内皮细胞与肿瘤细胞的相互作用，利用裸鼠成瘤性实验明确内皮细胞在肿瘤发生发展中的生物学作用。与此同时，在以上实验基础上我们利用SiRNA干涉内皮细胞的HIF-1α的表达，初步探讨HIF-1α在内皮细胞的生物学功能发挥中所扮演的角色。
　　 结果表明：内皮细胞促进肿瘤细胞的迁移，侵袭能力，促进移植瘤的生长，参与并促进肿瘤血管形成；肿瘤细胞上调内皮细胞HIF-1α的表达。SiRNA干涉内皮细胞HIF-1α的表达后，体外对肿瘤细胞的迁移、侵袭能力的促进明显下降，体内移植瘤生长速度及肿瘤血管密度与单独移植肿瘤组无明显差异，但较正常内皮细胞组明显下降。说明HIF-1α在内皮细胞促进肿瘤血管形成过程中发挥了关键性的作用。
　　 本课题通过以上两个部分的研究，结论如下：
　　 1.建立了hESCs向EPCs诱导分化的技术体系，诱导后的EPCs可以大量扩增，为进一步研究内皮（祖）细胞发育、分化与增殖奠定了一定基础。
　　 2.内皮细胞可以促进肿瘤血管形成并提高了肿瘤细胞生长与浸润的能力，内皮细胞中的HIF-1α在这一过程中发挥了关键性的作用。

目录

文摘

英文文摘

前 言

第一部分 人胚胎干细胞定向诱导生成内皮祖细胞

第一节 人胚胎干细胞的培养与鉴定

材料

方法

结果

第二节 人胚胎干细胞定向诱导生成内皮祖细胞

方法

结果

讨论

小结

第二部分 内皮细胞促进肿瘤生长的机制研究

第一节 内皮细胞参与肿瘤血管生成的实验研究

材料

方法

结果

第二节 RNA沉默内皮细胞HIF-1α对肿瘤成血管作用的研究

材料

方法

结果

讨论

小结

全文小结

参考文献

文献综述

参考文献

发表文章及参加会议情况

个人简历

致 谢