诱导多能性干细胞的建系及其体外向内皮细胞和造血祖细胞定向分化的实验研究

摘要

高效制备诱导多能性干细胞(iPS细胞)，并研究其向内皮细胞和造血祖细胞的定向分化能力，对组织工程中种子细胞的研究具有重要意义。本研究目的是探讨以磁性纳米粒子为基因载体的技术，高效制备iPs细胞并建系。进一步进行体外iPS细胞定向诱导分化为内皮细胞和造血祖细胞的实验研究。
　　 实验方法如下：
　　 1.以第5代PAMAM树形分子修饰磁性纳米粒子作为基因转染载体，将4种转录因子Oct4、Sox2、Nanog、Lin28，连同包装质粒psPAX2和包膜蛋白质粒PMD2.G，共同传染293T细胞，将所获得的含有4种基因的慢病毒和人成纤维细胞在37℃下共同孵育，直至产生胚胎干细胞(ES细胞)样细胞克隆。同样的方法，以脂质体为基因载体，作为对照组，比较两种载体在转载后生成的慢病毒滴度。
　　 2.ES样细胞克隆通过形态学、免疫荧光染色法、核型分析、类胚体及畸胎瘤形成等鉴定，证明iPS细胞的成功建系。
　　 3.改良传统ES细胞与OP9细胞共培养的诱导方式，运用OP9细胞产生的条件培养液，进行EB细胞悬浮法培养，在FLK1大量表达时，进行体外向内皮细胞和造血祖细胞的定向分化。
　　 结果显示，树形分子修饰的磁性纳米粒子能够将全部4种基因转载进入293T。细胞，所获得的慢病毒转导入人成纤维细胞，生成iPS细胞。其生成的慢病毒的滴度，为对照组脂质体转载生成慢病毒的10倍。免疫荧光、核型分析以及类胚体与畸胎瘤形成，显示iPS细胞具备多向分化潜能。并运用自创的OP9细胞条件培养液进行EB悬浮培养，在EB大量表达FLK1时，成功进行双向诱导，分别定向分化为内皮细胞和造血祖细胞。
　　 结论：树形分子修饰的磁性纳米粒子和慢病毒，能够高效地将Oct4、Sox2、Nanog、Lin28四个基因导入人成纤维细胞，建立iPS细胞。体外完成人的iPS细胞定向分化形成内皮细胞和造血祖细胞。