可溶性人类白细胞抗原G作为胚胎发育与着床潜能标志性分子的研究

摘要

研究背景：在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期中，选择具有着床潜能的胚胎移入患者子宫内是保证妊娠的前提。目前，国内外广泛采取单一的形态学评估方法挑选胚胎，但这种方法预测能力有限，亟需寻找可以更好地预测胚胎着床潜能的无创性指标。
　　近年来众多研究显示胚胎培养上清（ECs）中可溶性人类白细胞抗原G（sHLA-G）的表达与IVF结局具有相关性，有望成为临床选择移植胚胎的无创标志物，但既往研究中检测方法和培养条件多样，各个研究的结果无可比性，这些因素影响sHLA-G的检测及其对结局的预测作用，使其结论存在争议。
　　研究目的：通过一系列研究验证sHLA-G能否作为IVF中胚胎发育与着床潜能的标志性分子，以期为IVF-ET胚胎移植时提供无创性的选择标准，进一步提高IVF临床妊娠率，减少移植胚胎数以降低多胎妊娠的发生，从而改善IVF结局。
　　研究方法：本课题最大限度地标准化sHLA-G检测方法和胚胎培养中的一些重要参数，设计单中心回顾性研究、多中心大样本回顾性研究观察ECs中sHLA-G表达与IVF结局的关系。采用双抗夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测ECs中sHLA-G浓度，测得值高于最低检测浓度定义为sHLA-G阳性胚胎，低于最低检测浓度者定义为阴性胚胎。移植至少一个sHLA-G阳性胚胎的周期为sHLA-G阳性周期，移植胚胎全部为sHLA-G阴性者，定义为sHLA-G阴性周期，比较两组间的临床妊娠率（PR）与胚胎种植率（IR）。进一步设计前瞻性临床对照研究，拟行冻融胚胎移植（FET）患者采用随机原则分为两组，实验组解冻sHLA-G阳性胚胎进行移植，对照组解冻sHLA-G阴性胚胎进行移植，比较两组间PR与IR。在方法学上进行改进，采用电化学发光免疫方法(ECLI)对ECs中sHLA-G进行检测,并应用该方法开展单中心初步临床研究。
　　结果：
　　1.采用ELISA方法检测来自单中心53个ICSI周期的ECs共113份，在至少移植了一个sHLA-G阳性胚胎的sHLA-G阳性周期中，68.4％获得了临床妊娠，移植胚胎全部为sHLA-G阴性的阴性周期PR为39.4%(P＜0.05)。sHLA-G阳性周期的IR也高于阴性周期（51.3%vs24.3%，P＜0.05)。
　　2.多中心回顾性研究共检测了全国九家生殖中心924个IVF周期2041份ECs，25.5%（521份）检测到sHLA-G表达。移植胚胎全部为sHLA-G阳性胚胎共87个周期，部分移植sHLA-G阳性胚胎306周期,全部移植sHLA-G阴性胚胎531周期，三组的妊娠率分别为49.4%，55.2%和37.3%，（P＜0.05）。两两比较提示前两者PR均高于全部移植sHLA-G阴性者，但两者之间无统计学差异（P＞0.05）。前两者IR也高于全部移植sHLA-G阴性胚胎者，分别为30.8%，32.9%和23.0%（P＜0.05）。
　　各中心sHLA-G阳性周期PR与IR均高于sHLA-G阴性周期，其中A,C,E三个中心两组间PR与IR的差异均有统计学意义，B中心两组间的PR和H中心两组间IR的差异也有统计学差异。综合九家中心，sHLA-G阳性周期的PR与IR均高于阴性组（53.9%与%32.5vs37.3%与23.0%，P＜0.05），而两组间流产率和异位妊娠发生率均无统计学差异（6.6%与2.4%vs6.1%与5.1%，P＞0.05）。
　　按受精方式分层分析，IVF组中，sHLA-G阳性周期PR与IR均高于同组的阴性周期（PR:55.0%vs36.1%，IR:33.7%vs22.6%，P＜0.05），ICSI组也观察到类似的结果（PR:51.3%vs37.2%,IR:29.4%vs22.6%，P＜0.05）;按年龄段分层分析，年龄≤35岁组与年龄＞35岁组中，sHLA-G阳性周期PR与IR均高于各自的阴性周期（≤35岁组PR：54.6%vs40.0%,IR:34.4%vs25.6%，＞35岁组PR：51.2%vs27.4%,IR:26.0%vs14.9%P＜0.05）；按培养液体系分层分析，Vitrolife组与Quinn’s组中，sHLA-G阳性周期PR和IR分别为56.4%与33.9%（Vitrolife），54.1%与32.9%（Quinn’s）均高于各自的sHLA-G阴性周期（Vitrolife：41.3%与25.2%，Quinn’s：35.0%和21.4%P＜0.05）。
　　全部植入周期的移植胚胎中sHLA-G阳性胚胎占35.6%，高于全部未植入周期移植胚胎中sHLA-G阳性胚胎的百分率19.2%（P＜0.05）。
　　ECs中sHLA-G的表达与相应的胚胎评分行Kendall等级相关分析，相关系数tau_b=-0.057，P＜0.05，提示两者之间无相关关系。
　　妊娠相关因素的Logistic多元回归分析显示进入模型的变量为sHLA-G表达、年龄和获卵数。sHLA-G阳性表达与妊娠结局呈正相关关系，OR值为2.170，P＜0.05。
　　3.FET前瞻性研究中，实验组7例患者中6例获得临床妊娠（85.7%），对照组25例中13例获得妊娠（52.0%），两者相比无统计学差异(P＞0.05)。实验组IR为55.6%，高于对照组（27.3%）差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　4.采用在商品化ELISA试剂盒基础上改良的电化学免疫发光检测方法，检测胚胎培养上清sHLA-G敏感度是ELISA的6.28倍，单中心92个IVF周期结果显示sHLA-G阳性周期PR和IR分别为51.9%和31.5%，均高于sHLA-G阴性周期（30%与14.9%，P＜0.05）。
　　5.采用人工基因合成技术合成了HLA-G5cDNA序列全长，并成功构建了HLA-G5表达慢病毒载体。
　　结论：胚胎培养上清中sHLA-G的表达可能是胚胎着床与发育潜能的重要标志物，将为IVF胚胎移植时提供无创性的胚胎选择标准。

目录

封面

声明

目录

缩 略 词

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分：SHLA-G作为胚胎发育与着床潜能标志性分子的临床研究

第二部分：电化学发光法检测胚胎培养上清中 sHLA-G 水平的初步临床研究

第三部分：HLA-G5慢病毒表达载体构建与病毒包装

全文小结

参考文献

文献综述

参考文献

在读期间发表论文情况

致谢