细胞因子IL-2，15联合自体DCs对人外周血来源的NK细胞体外扩增及功能影响的研究

摘要

目的意义：供者异源反应性NK细胞在异基因造血干细胞移植中可以发挥移植物抗白血病（graft-versus-leukemia，GVL）效应，并减少移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）的发生[1-3]；在实体瘤（如肾细胞癌、黑色素瘤）也有裂解肿瘤细胞的抗实体瘤作用。故输注供者异源反应性NK细胞已经成为临床移植及抗肿瘤辅助治疗的新策略[4，5]。但外周血中NK细胞含量少，目前尚缺乏有效的体外扩增体系。本研究目的在于探讨从人外周血中分选及扩增高纯度NK细胞的方法，尤其是自体Dcs作为饲养细胞的可行性及效果，并对扩增后NK细胞功能进行评价，以期筛选出有效的NK细胞体外扩增方法，为进一步的临床应用奠定基础。
　　 材料和方法：先采用miniMACS免疫磁珠分选方法，从外周血单个核细胞（PBMNC）得到纯化的CD14+单核细胞及NK细胞，随后体外经GM-CSF及IL4诱导单核细胞5天，成为非成熟DCs。在干细胞培养基条件下，NK细胞经IL2和IL15培养5天后，培养体系中加入不同比例的DCs，根据与DC混合的比例及方式将培养体系分为5组：A组：NK/DC=10:1，B组：NK/DC=5:1；C组：NK/DC=2:1，D组：NK/DC=1:1 transwell非接触共培养，E组（对照组）：不加DC。培养15天，每3天半量换液并补充细胞因子；检测分选及扩增前后（CD3-CD56+）NK细胞含量、扩增倍数及扩增前后各组NK细胞功能的变化（从以下三方面进行）：在不同效靶比下对K562细胞的杀伤作用；tealtime-PCR方法定量检测IFN-γ、穿孔素、颗粒酶B mRNA的表达水平；流式检测NK细胞表面KIR3DL1、NKG2D表达的变化，并探寻可能的miRNA调控机制。
　　 结果：（1）经miniMACS阴性免疫磁珠分选后（CD3-CD56+）NK细胞含量由分选前的11.19±5.25％提高到94.23±3.50％。培养15天后除C组NK细胞纯度略有下降外，其余四组与扩增前无显著性差异（P>0.05）；（2）在各培养体系中A、B、C、D组细胞的扩增倍数分别为168±64.4、170.5±82.6，244.8±148，和70.8±17.5，均显著高于对照组（未加DCs）的50.46±4.3（P<0.01）：（3）培养后NK细胞对K562细胞的杀伤活性呈A组≈B组（P>0.05）>C组>D组>E组（P<0.05）。（4）各扩增体系NK细胞IFN-γ、Perforin及Granzyme B基因的表达量均较扩增前（NKO组）明显增加（P<0.01）。（5）细胞因子扩增后CD158e+的细胞下降约10％（P<0.05）。荧光素酶报告实验显示miR-146b可与KIR3DL13'UTR在靶位点特异结合，很有可能调控KIR3DL1的基因表达。
　　 结论：经miniMACS免疫磁珠阴性分选得少量高纯度NK细胞后，在含IL2（200U/mL）+IL15（20ng/mL）的SCGM（含5％人AB血清的）培养条件下，以人外周血单核细胞诱导的未成熟DC作为饲养细胞，当NK细胞与DC比例为10:1时，我们可以获得纯度高、细胞毒活性强、增值倍数高的NK细胞。荧光素酶报告实验显示miR-146b很可能参与调控KIR3DL1的表达。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写词索引

前 言

第一部分细胞因子IL-2,15联合自体DCs对人外周血来源的NK细胞体外扩增

第一节 材料和方法

第二节 实验结果

第三节 讨论

第四节 小结

第二部分 扩增后NK细胞的功能的研究

第一节 材料和方法

第二节 实验结果

第三节 讨论

第四节 小结

第三部分 microRNA调控NK细胞KIR3DL1受体表达机制初探

第一节 材料和方法

第二节 实验结果

第三节 讨论

第四节 小结

全文结论

参考文献

综 述

参考文献

综述二

参考文献

攻读学位期间发表文章

致 谢