Alphastatin作用下EC304细胞蛋白质差异表达的实验研究

摘要

胃癌是一种常见的危害人类健康的疾病,其治疗方式主要依赖于手术切除,术后采用以化疗为主的辅助治疗。研究表明,胃癌血管新生在其发生、发展和转移过程中发挥重要作用。近年来,肿瘤血管新生抑制剂已成为恶性肿瘤治疗领域的热点,有些正在临床试验中。Alphastatin具有很强的抑制血管内皮细胞管状结构形成和抗鼠源性CT26生长的作用,显示出良好的应用前景。为此,我们开展了Alphastatin治疗胃癌及其作用机理的研究。目的是评价Alphastatin抑制胃癌血管新生的可行性和有效性,为进一步研究治疗其他恶性肿瘤提供实验基础,进一步探讨Alphastatin发挥血管新生的作用机制,为阐述其生物学活性提供理论依据。有关抗血管新生的具体机制国内外的研究较多,但对其蛋白表达的研究较少。本研究寻找与Alphastatin相互作用、且在抗血管新生过程中起重要作用的蛋白,并且通过免疫荧光等技术确定它们在信号通路中的上下游关系,从而探讨Alphastin在抗血管新生过程中的可能作用机制。
　　 目的：探讨Alphastatin,作用下人脐静脉内皮细胞EC304内蛋白质表达谱的变化。
　　 方法：传代培养EC304细胞,随机分为Alphastatin组和对照组。提取各组EC304细胞内蛋白质,应用蛋白质双向凝胶电泳(2-DE)技术,分析在Alphastatin作用下EC304细胞蛋白质组表达的差异。运用ImageMaster2D Platinmm5.0凝胶图像分析软件对2-DE凝胶图像进行差异表达分析,差异明显蛋白点经胶内酶切后用纳升超高效液相色谱-电喷雾串联质谱进行分析,通过Mascot数据库检索鉴定差异蛋白质。并对检索出的差异蛋白通过western blot及免疫荧光方法进行验证。
　　 结果：①对照组和Alphastatin组平均识别到1350±90个蛋白质点,图像分析匹配率约为70-82％,共找到29个有显著差异的蛋白质点,其中上调蛋白质斑点10个,下调蛋白质斑点17个,新增蛋白质斑点2个,消失1个。这些差异点主要分布在pI4.0-9.2、分子量14.0kDa-100.0kDa之间,表达上调的倍数一般在3-25倍,下调最低至0.1倍。②采用纳升超高效液相色谱-电喷雾串联质谱技术,分析了29个质谱兼容银染凝胶重复性好的差异蛋白质斑点,鉴定出23个有意义的蛋白质。Mascot检索分值64～666,配数3～27,序列覆盖率8～62％。③质谱分析鉴定出核苷双磷酸化激酶A(Nm23 protein)及profilin-2 isoform b等23种蛋白质,前者参与多种生物行为,如细胞增殖,分化和发展,信号转导,G蛋白偶联的受体介导内吞以及基因表达。而后者可调节胞外信号导致的肌动蛋白多聚化,可以影响细胞骨架结构。④通过对Nm23 proteing及profilin-2 isoform b的western blot及免疫荧光分析,发现Nm23 protein及profilin-2 isoform b在Alphastatin实验组中表达显著下降。
　　 结论：⑴Alphastatin作用于EC304～胞后能引起蛋白质表达发生差异性明显的变化,说明Alphastatin可能通过调节蛋白质含量或传导通路的途径发挥EC304细胞调节作用。⑵通过质谱分析技术鉴定出的差异显著的蛋白质,结果真实可靠,查阅文献发现检出蛋白质与血管新生和抗血管新生作用相关。证明蛋白质组学方法在研究Alphastatin作用机制及探讨胃癌的抗血管新生治疗中发挥重要的作用。⑶对于检出蛋白采用western blot及免疫荧光染色方法进一步验证了质谱分析结果。分析AlphaStatin可能通过Nm23 protein及profilin-2 isoform b等几种蛋白参与细胞的调节并发挥抗血管新生的功能,为研究胃癌的抗血管新生治疗提供了新的研究方向。