乌司他丁对烧伤后免疫功能障碍的干预效果研究

摘要

目的：
　　脓毒症是严重烧伤患者的主要并发症和首要死亡原因，脓毒症的发生发展与免疫功能障碍密切相关。失控性炎症反应在烧伤后免疫功能障碍中扮演重要角色。乌司他丁被用于烧(创)伤后全身性炎症反应的治疗，而乌司他丁对免疫功能的保护效果如何，尚待研究证实。本研究通过以下两部分实验初步探讨乌司他丁对烧伤后免疫功能障碍的影响。
　　动物实验：采用烫伤大鼠模型，观察乌司他丁对烫伤大鼠脾脏高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的表达和外周血调节性T细胞(Treg，CD4+CD25+)构成比的影响：探讨乌司他丁对烫伤大鼠辅助性T淋巴细胞的功能性极化的影响和可能机制；观察乌司他丁对烫伤大鼠抗原递呈功能的影响。
　　临床研究：对烧伤患者进行动态监测，明确其外周血Treg细胞比例的变化规律，观察乌司他丁对患者Treg细胞比例的影响，探讨可能机制；观察烧伤患者辅助性T淋巴细胞的功能性极化的状态，探讨乌司他丁对辅助性T淋巴细胞的功能性极化的影响和可能机制；观察乌司他丁对烧伤患者抗原递呈功能的影响。
　　方法：
　　动物实验：120只Wistar大鼠随机分为假烫组(S组)、烫伤组(B组)和烫伤+乌司他丁治疗组(BU组)，(n=40)。后两组大鼠制作30％TBSAⅢ度烫伤模型。伤后即刻腹腔注射林格液(40 ml/kg)或乌司他丁(4×104U/kg)+林格液(40 ml/kg)抗休克，创面涂碘伏。假烫组于37℃水浴中12 s行假烫，伤后即刻腹腔注射林格液(40 ml/kg)。于伤后1、3、5、7d四个时间点，S组和B组腹腔注射4mL林格液，BU组给予4×104U/kg乌司他丁+4mL林格液。各组分别于伤后1、3、5、7、14d腹主动脉无菌采血，并分离获取大鼠脾脏组织。Western blotting检测大鼠脾组织HMGB1的表达，流式细胞术检测血液中CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)比例、单核细胞Ia抗原表达率，ELISA检测血清中IL-4和IFN-γ水平。
　　临床研究：烧伤面积≥30％TBSA的患者30例，随机分为常规治疗组(13例)和乌司他丁+常规治疗组治疗(17例)。常规治疗包括补液抗休克、抗生素抗感染、创面换药、手术切痂植皮、营养支持治疗等。乌司他丁治疗组除常规治疗外，8×105U乌司他丁溶于500ml0.9％生理盐水注射液中静脉滴注，2次/日，连续7日。分别于治疗前及治疗后1d、3d、5d、7d、14d采外周静脉血，另取20例健康体检者外周静脉血作为对照。流式细胞术检测外周血中Treg细胞比例、CD14+单核细胞HLA-DR抗原表达率，ELISA检测血清中IL-4和IFN-γ水平。
　　结果：
　　动物实验：
　　1.与假烫组相应时间点比较，烫伤组大鼠脾组织HMGB1水平在伤后1d～7d显著升高(P<0.01)，伤后3d时表达量最高。乌司他丁治疗后1d～7dHMGB1水平有不同程度的降低，在治疗后5d表达量最低。
　　2.与假烫组相应时间点比较，烫伤大鼠外周血Treg细胞比例在伤后逐渐上升，伤后3d时达峰值(P<0.01)，乌司他丁治疗后烫伤大鼠外周血Treg细胞的比例降低。
　　3.烫伤组大鼠1d～7d血清中IFN-γ浓度明显低于假烫组，而IL-4明显高于假烫组，烫伤组大鼠的Th1/Th2发生了Th2方向的漂移。经乌司他丁治疗后，伤后血清中的IL-4明显减少，而IFN-γ则明显增加。
　　4.假烫组大鼠单核细胞Ia抗原阳性率始终维持在较高水平，烫伤后即有明显的降低，伤后1d即开始缓慢升高，但是在实验全程仍然显著低于假烫组大鼠(P<0.05或P<0.01)。乌司他丁治疗后烫伤组大鼠单核细胞Ia抗原阳性率升高。
　　临床研究：
　　1.烧伤后患者外周血中Treg细胞比例于伤后1d即升高，在整个时相段内均高于健康对照组(P<0.01)。相对于常规治疗组，乌司他丁治疗Treg胞比例下降。
　　2.健康体检者血清中IL-4和IFN-γ浓度较低，常规治疗组患者血清中IL-4浓度较健康对照组明显增高(P<0.01)，而IFN-γ浓度则显著降低(P<0.05或P<0.01)。相对于常规治疗组，乌司他丁治疗后患者血清中的IL-4浓度明显降低(P<0.05或P<0.01)，伤后血清IFN-γ浓度则明显增高(P<0.05或P<0.01)。
　　3.严重烧伤患者外周血CD14+单核细胞HLA-DR抗原表达率在全部观测时点较健康对照组显著降低(P<0.01)，而乌司他丁+常规治疗后有明显改善(P<0.05或P<0.01)，HLA-DR抗原表达率持续升高，在第14天时改善最为明显。
　　结论：动物和临床试验表明，严重烧伤后HMGB1升高晚、持续时间长，外周血中Treg细胞比例升高，辅助性T淋巴细胞向Th2漂移，血清中IFN-γ和IL-4浓度异常，单核细胞Ia抗原和单核细胞HLA-DR抗原表达率降低。抗原递呈功能减弱。乌司他丁治疗严重烧伤，能够降低伤后大鼠脾脏HMGB1的表达，调节上述指标，改善烧伤后免疫功能。乌司他丁对烧伤后免疫功能的改善可能是通过降低HMGB1的表达，抑制Treg细胞的成熟，继而改善辅助性T淋巴细胞的极化状态实现的。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略词表

前言

第一部分 乌司他丁对烫伤大鼠高迁移率族蛋白B1表达及免疫功能的影响

材料与方法

一、主要试剂

二、主要仪器

三、实验动物及分组

四、标本采集与处理

五、指标检测与方法

六、统计学处理

实验结果

讨论

主要结果总结和结论

第二部分 乌司他丁对烧伤患者免疫功能的影响

材料与方法

一、主要试剂

二、主要仪器

三、临床资料及分组

四、标本采集与处理

五、指标检测与方法

六、统计学处理

实验结果

讨论

主要结果总结和结论

参考文献

综述

参考文献

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