Sirt1在自发性高血压大鼠心肌中的表达及其在瑞舒伐他汀心肌保护中的作用

摘要

目的:研究老年自发性高血压大鼠(SHR)心肌中Sirt1的表达、瑞舒伐他汀对心室重塑及心功能的保护作用及其对Sirt1通路蛋白表达的影响,结合体外实验探讨Sirt1通路在瑞舒伐他汀保护心肌细胞氧化损伤中的作用。
　　方法:1.20月龄雄性SHR及年龄匹配的雄性WKY大鼠,分为WKY对照组、SHR空白组、SHR瑞舒伐他汀组、SHR氨氯地平组、SHR联合用药组,每组10只。氨氯地平10mg/kg/d,瑞舒伐他汀钙40mg/kg/d掺入相应大鼠标准饲料中,喂养10周;2.测量各组大鼠体重、鼠尾动脉血压、血脂;实验结束时心脏超声测量室壁厚度,左心室内径、射血分数、二尖瓣E/A,组织多普勒Sm、Em等指标,左心室插管及股动脉插管行血流动力学检查,测量左心室舒张末压(leftventricularend-diastolicpressure,LVEDP)、左心室内压上升最大速率(+dp/dtmax)、左心室内压下降最大速率(-dp/dtmax)、舒张时间常数τ。处死大鼠,全心称重,Masson染色观察心肌间质纤维增生情况,检测血浆及心肌匀浆丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平;末端脱氧核酸转移酶介导的d-UDP缺口末端标记(Terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediatedd-UDPnickendlabelling,TUNEL)法检测心肌细胞凋亡情况,WesternBlotting检测大鼠心肌Sirt1、FoxO1及调亡蛋白Caspase3/cleavedCaspase3、Bcl-2/Bax的表达;3.培养新生大鼠原代心肌细胞,分别以不同浓度和不同时间的瑞舒伐他汀钙处理,观察瑞舒伐他汀对心肌细胞Sirt1/FoxO1表达的影响;4.构建Sirt1干扰RNA慢病毒(shRNA-Sirt1);5.将新生大鼠原代心肌细胞分为溶剂对照组(DMSO),对照慢病毒组(DMSO+LV-GFP),H2O2造模组(LV-GFP+200μMH2O2),瑞舒伐他汀组(LV-GFP+瑞舒伐他汀钙+200μMH2O2)和干扰慢病毒组(瑞舒伐他汀钙+LV-shRNA-Sirt1+200μMH2O2),细胞上清行氧自由基(reactiveoxygenspecies,ROS)、MDA检测,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况,TUNEL染色和流式细胞仪检测各组心肌细胞凋亡情况;6.将新生大鼠原代心肌细胞分为H2O2造模组,瑞舒伐他汀组、干扰慢病毒组和白藜芦醇(Resveratrol,RSV)阳性对照组(RSV50μM),qRT-PCR比较各组心肌细胞Sirt1和FoxO1mRNA的表达,WesternBlotting检测心肌细胞Sirt1/FoxO1/Caspase3/cleavedCaspase3/Bcl-2/Bax蛋白的表达。
　　结果:1.瑞舒伐他汀组用药前后无创血压无明显变化,氨氯地平和联合用药组用药前后血压明显下降;2.SHR空白组心肌间质纤维化较WKY对照明显增加,而氨氯地平和瑞舒伐他汀组心肌间质纤维化较SHR空白组明显减轻,联合用药组SHR心肌间质纤维化较各单药组进一步显著减轻;3.各SHR组左室舒张末期室间隔和左室后壁较WKY对照组均显著增厚,左室内径、射血分数、E/A、Sm各组间均未见显著差异,但SHR的E/Em显著升高,3用药组E/Em较SHR空白组均明显回落;4.各组间+dP/dtmax未见显著性差异。与WKY对照组比较,SHR空白组的-dP?dtMax、左室舒张末压和舒张时间常数τ均显著升高,氨氯地平组和瑞舒伐他汀组较SHR空白组有明显回落,联合用药组则进一步降至与WKY对照组一致的水平;5.与WKY对照组比较,SHR空白组心肌组织及血清中MDA含量、TUNEL染色心肌细胞凋亡指数明显升高,氨氯地平和瑞舒伐他汀组较SHR空白组明显下降,联合用药组则进一步降至WKY对照同等水平;6.和WKY对照组比较,SHR空白组心肌细胞Sirt1/FoxO1/Bcl-2蛋白表达减少,CleavedCaspase3/Bax蛋白表达增加,和SHR空白组比较,瑞舒伐他汀组及联合用药组Sirt1/FoxO1/Bcl-2蛋白表达显著增加,CleavedCaspase3/Bax表达显著降低。氨氯地平对Sirt1和FoxO1的表达未见显著影响;7.与溶剂对照组比较,H2O2造模组心肌细胞ROS、MDA含量显著增加,MTT显示细胞生存和增殖明显减少,TUNEL染色和流式细胞检测显示心肌细胞凋亡显著增加。瑞舒伐他汀组以上损伤明显改善,干扰慢病毒组瑞舒伐他汀的以上保护作用减弱;8.H2O2造模组心肌细胞Sirt1/FoxO1/Bcl-2表达下降,CleavedCaspase3/Bax蛋白表达增加,瑞舒伐他汀组H2O2刺激下的Sirt1/FoxO1/Bcl-2蛋白表达增加,CleavedCaspase3/Bax蛋白表达减少。shRNA-Sirt1干扰心肌细胞Sirt1基因使瑞舒伐他汀的以上作用减弱。
　　结论:1.老年SHR存在明显的左心室肥厚、心肌纤维化、左心室舒张功能障碍及明显的氧化应激损伤;2.老年SHR心肌组织Sirt1表达明显降低;3.瑞舒伐他汀可以逆转老年SHR心肌纤维化,改善左心室舒张功能,减轻心肌氧化应激损伤,并使心肌组织中Sirt1表达明显回复;4.体外实验进一步证实,瑞舒伐他汀改善心肌氧化应激、减少细胞凋亡,其机制可能是通过激活Sirt1/FoxO1通路实现的。

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中文摘要

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前言

第一部分 Sirt1在老年SHR心肌中的表达及瑞舒伐他汀钙对老年SHR的心脏保护作用

一、材料和方法

（一）主要试剂

（二） 实验仪器

（三） 主要试剂的配置

（四） 实验动物

（五）实验方法

二、结 果

三、讨 论

（一）瑞舒伐他汀对老年SHR心室重构和心功能的保护作用

（二）瑞舒伐他汀通过保护心肌氧化损伤而发挥心肌保护的作用

（三）Sirt1在老年SHR心肌中的表达及其在瑞舒伐他汀心肌保护中的作用

四、小 结

第二部分 Sirt1通路在瑞舒伐他汀心肌保护中作用

一、材料和方法

（一） 主要试剂

（二） 实验仪器

（三） 主要试剂的配置

（四）实验动物

（五）实验方法

二、结 果

三、 讨 论

一、瑞舒伐他汀对H2O2诱导的心肌细胞氧化应激及凋亡损伤的保护作用

二、瑞舒伐他汀对心肌细胞Sirt1表达的作用

三、Sirt1通路在瑞舒伐他汀保护心肌氧化损伤中的作用

四、小 结

全 文 总 结

参考文献

综述SIRT1信号通路与心血管系统

参考文献

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