应用iTRAQ技术对阿尔茨海默病患者和正常老人颞叶组织进行差异蛋白分析

摘要

研究目的及意义:阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是痴呆最常见的一种类型,约占老年痴呆的55％,其病理特征是细胞外β-淀粉样蛋白沉积所致老年斑(senile plaques, SP)和细胞内过度磷酸化的tau蛋白所致神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT),其常见的沉积部位如海马,额叶和颞叶。老龄脑与AD有着相互重叠的病理和生化改变。应用蛋白质组学技术从整体角度分析细胞内的蛋白质组成和表达水平,将有助于筛选出AD早期诊断的分子标志物,有的或可成为新药设计的分子靶点。本研究旨在分析正常老年人和AD患者颞叶脑皮质组织中的差异蛋白,为进一步研究AD发病机制奠定基础。
　　主要内容:从解放军总医院老年医学研究所老年组织库中选取12例尸检的老年人颞叶脑皮质组织标本,分为正常老年组(n=6)和AD组( n=6),1.利用HE、免疫组织化学方法对病例进行筛选,根据病理诊断标准确诊后,结合临床诊断分组;2.应用同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)及二维液相色谱-串联质谱(two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry,2D LC-MS/MS)方法鉴定蛋白,利用生物信息学分析工具DAVID对质谱鉴定的蛋白进行GO功能注释、蛋白质功能富集分析及PATHWAY定位分析,并分析差异蛋白在AD发病机制中的作用。3.对差异蛋白进行western blot验证,验证蛋白质组分析的稳定性和准确性。
　　结果:在正常老年组和AD组尸检的颞叶脑皮质组织中,经质谱鉴定共获得3071种蛋白,生物信息分析差异蛋白质有146种,与正常老年组相比,AD组中,有62种蛋白质表达上调和84种蛋白质表达下调。进一步分析从146种差异蛋白中发现7种AD通路相关蛋白(p=7.8E-3),即基因转录翻译的差异蛋白质:丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen activated protein kinase-1,MAPK-1)、NADH脱氢酶(nicotinamide adenine dinucleotide[H], NADH)亚基Ⅵ、亚基Ⅹ和细胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase, COX)亚基Ⅰ、亚基Ⅱ、亚基Ⅲ和亚基Ⅳ。western blot验证显示,MAPK-1蛋白在AD组中较正常老年组中表达上调,是正常老年组的1.473倍,而iTRAQ蛋白质组学分析显示AD组MAPK-1蛋白表达也是同样上调,AD组是正常老年组的1.57倍,证明蛋白质组学结果较好的可信度和准确性。结论:iTRAQ技术快速、有效地筛选出多种与AD相关的差异蛋白,为AD疾病采取有效预防措施或寻找治疗靶点的研究提供了基础性数据资料。
　　本文旨在研究正常增龄和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)小脑结构异同点。将收集的20例尸检的老年男性小脑皮层组织分为3组:中年组、正常老年组和阿尔茨海默病(AD)组。Nissl染色用于测量小脑皮层颗粒细胞数量和小脑皮层的厚度变化、免疫组织化学观察胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫染色的星型胶质细胞和钙结合蛋白D28K(CB)免疫染色的蒲肯野细胞(Purkinje cells, PCs)数量的变化。结果显示,与中年组相比,在正常老年组,分子层、颗粒层和小脑总皮层厚度显著减小(p<0.05),蒲肯野细胞(Purkinje cells, PCs)和颗粒细胞密度均减小(p<0.05);星型胶质细胞的数目显著增加;在AD组与正常老年组比较显示, AD组分子层和小脑总皮层厚度明显减小(p<0.05),星型胶质细胞数量有所增加。结果提示,正常增龄和AD的过程均影响人小脑皮层结构变化,主要表现在PCs和颗粒细胞数目减少,而星型胶质细胞数目的增加。

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英文缩略语

中文摘要

英文摘要

前言

一、材料

二．方法

结果

1. 病理染色和病例诊断

2. 蛋白质定量结果

3. 蛋白质功能聚类分析

4. 蛋白质功能富集分析

5. PATHWAY通路分析

6. Western blot验证结果

结论

讨论

参考文献

第二部分 正常增龄的老年人和阿尔茨海默病患者小脑结构改变

中文摘要

英文摘要

前言

一、材料

二、实验方法

结果

1. HE染色

2. Nissl染色

3. CB免疫反应

4. GFAP免疫反应

讨论

参考文献

综述

参考文献

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