肾移植术后BK病毒感染流行病学监测及病毒特异性细胞免疫反应的研究

摘要

目的与意义:
　　BK病毒(BK virus,BKV)属于多瘤病毒(polyomavirus)一种,是导致肾移植术后移植物肾病的重要危险因素。随着肾移植手术的广泛开展,由BKV感染导致移植物功能受损、进展为BK病毒性肾病(BKVN)进而导致移植物丢失的病例报道逐渐增多。根据国外研究显示,在肾移植受者中有1％~5%的人会发生BKVN,其中大约50%导致移植肾失功,由此引起了移植学者的高度重视。当前对引起BKV感染或病毒激活的危险因素尚不明确,而BKVN与强效免疫抑制剂的广泛应用的时间几乎同时出现,意味着机体细胞免疫功能的改变扮演了重要角色,由此大多数学者认为移植受者机体免疫抑制状态是引起BKV感染复发的最重要因素。然而,目前国外对肾移植受者BKV感染免疫状态监测的研究非常少见,国内则未发现有文献报道针对该领域的探索。因此,本课题在我研究所前期对BKV感染流行病学研究的基础上,进一步开展前瞻性随机对照研究,通过监测观察移植受者的细胞和体液免疫状态,揭示BKV感染的免疫机制,为BKV感染和发生BKVN的移植受者监控以及治疗方案的选择提供免疫学理论依据。
　　方法:
　　1、研究对象选择:选择在解放军第309医院器官移植研究所进行同种异体肾移植术的受者作为研究对象,并选择同时期健康人群做为阴性对照组。
　　2、标本的采集:入组的研究对象于术前及术后每三个月定期收集尿液和血液标本,进行real-time PCR BKV DNA载量监测,对于符合标准的研究对象活检穿刺,行病理学检查。
　　3、研究对象分组:根据BKV感染筛查结果将研究对象分为四组,即正常受者、病毒尿症受者、病毒血症受者和病毒性肾病受者。
　　4、BKV感染监测方法:检测研究对象尿液和血液BKV DNA载体量:收集研究对象尿液及外周血标本,应用BKV试剂盒(我所专利技术,专利号:201110211891.1)通过real-time PCR技术检测移植术后受者尿液及外周学标本BKV DNA载量。检测阳性标准为大于或等于1×103copies/ml。
　　5、BKV特异性免疫反应的检测方法:细胞免疫反应检测方法:提取并纯化研究对象外周血单个核细胞(PBMC),流式细胞仪检测研究对象CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群。制备包含BK病毒 VP1、VP2、VP3、LT-Ag和st-Ag肽段的重叠肽池(overlapping peptide pools),应用重叠肽池与PBMC混合培养,体外刺激PBMC生成相应的细胞因子,应用流式细胞仪检测体外培养后PBMC中CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群,应用流式细胞学检测INF-γ/IL-2/TNF-α诱导型BK病毒特异性T细胞增殖情况,分析BKV细胞免疫反应状态。
　　6、其他相关临床资料的收集:一般临床资料(包括研究对象性别﹑年龄﹑供肾类型﹑配型情况、术后并发糖尿病(PTDM)﹑急性排斥反应和(AR)术后早期肺部感染(pneumonia)以及免疫诱导方案、单独和联合免疫抑制方案等相关资料);实验室指标(重点记录移植肾功能指标(血肌酐、尿素氮、尿酸)、免疫抑制药物浓度、血常规、尿常规等相关实验室检验指标)7、统计学方法:应用Excel2007软件进行实验数据录入及表格绘制。应用SPSS统计软件(16.0版)统计学分析,符合正态分布的数据应用平均值±标准差表示,并应用随机分组t检验、方差分析进行统计学分析,不符合正态分布的数据应用平均值,最小值和最大值表示,并应用秩和检验进行统计学分析。应用ROC曲线下面积对比分析BK病毒尿症和BK病毒血症预测BKVAN进展的价值,应用相关分析和logistic回归分析BK病毒感染的危险因素。应用graphpad(5.0版)软件进行绘图制作。
　　结果:
　　1、尿液BKV DNA载量预测BKVN发生的阳性指标为5.04±0.15 log10copies/ml,血浆BKV DNA载量为4.08±0.10 log10copies/ml。尿BKV DNA载量指标预测BKVN发生的敏感度100%,特异度57.7%(P=0.003),其阳性预测值(PV+)为26.3%,阴性预测值(PV-)为95.7%。应用血BKV DNA载量指标预测BKVN发生的敏感度100%,特异度82.9%(P=0.002),其阳性预测值(PV+)为83.3%,阴性预测值(PV-)为98.8%。
　　2、在对210例肾移植术后早期受者的临床观察中,尿BKV DNA阳性者92例(43.8%),尿BKV DNA载量中位数为4.32×105copies/ml(5.73×103~9.44×109 copies/ml);血BKV DNA阳性者46例(21.9%),血BKV DNA载量中位数为5.55×103 copies/ml(3.28×103~11.38×106 copies/ml],病理学活检证实BKVN者7例(3.3%)。术后6~9个月是病毒尿症和病毒血症发生率最高的时间点。
　　3、服用FK506是术后发生病毒血症的危险因素(r=0.232,P=0.012),服用CsA对发生病毒血症的影响显示了负相关关系(r=-0.232,P=0.012)。其余各种免疫诱导治疗方案(ATG/IL-2R/无诱导)与术后BKV感染的发生未发现统计学相关性(P>0.05)。术前病毒血症阳性与移植术后BKV感染有统计学相关性(P<0.05)。性别﹑供肾类型﹑术后糖尿病、急性排斥反应、术后早期肺部感染均与BKV感染无统计学相关性(P>0.05)。
　　4、肾移植术后病毒血症受者的术后3个月内最低肌酐值为108.6±31.5μmol/L,发现BK病毒血症时的血清肌酐值为187.5±85.6μmol/L,两者比较有统计学显著差异(P<0.001)。而病毒尿症受者在发生前后血肌酐比较未见统计学差异(P>0.05)。
　　5、肾移植术后受者BKV特异性蛋白VP1、VP2、VP3、LT和st体外刺激细胞免疫反应以CD4+ T细胞占优势比例(>90%)。在发生病毒血症和BKVN时VP1、VP2、VP3体外刺激IL-2/IFN-γ+/TNF-α+ CD4+T细胞免疫反应强度均明显下降(P<0.05)。LT、st体外刺激细胞性免疫反应变化差异未见统计学差异(P>0.05)。
　　6、肾移植术后病毒尿症和病毒血症受者在体外刺激IL-2/IFN-γ+/TNF-α+ CD4+ T细胞免疫反应强度中VP1、VP2、VP3蛋白的反应强度普遍高于LT和st蛋白,而VP1和 VP3蛋白又显著高于 VP2蛋白(P<0.05),两两比较均具有统计学意义显著差异(P<0.05)。
　　7、肾移植术后持续BKV病毒血症受者易发展为BKVN,此类受者的5种BKV特异性蛋白体外刺激IL-2/IFN-γ+/TNF-α+ CD4+ T细胞反应强度呈明显下降趋势。在持续病毒尿症受者中未发现类似现象。
　　结论:
　　1、应用我研究所自行研发的BKV DNA载量检测试剂盒预测BKVN的指标为:尿液BKV DNA载量阳性值为107copies/ml,血浆BKV DNA载量阳性值为105copies/ml。即当检测标本BKV DNA载量大于阳性值时可作为明确BKVN的诊断指标。
　　2、肾移植术后早期应规律定期监测尿、血标本中BKV DNA载量变化,尤其在术后6~9个月是BKV感染的高峰时段,监测BKV感染的间隔时间最长不应超过3个月,对持续BK病毒尿症受者必须进一步明确病毒血症的发生。
　　3、FK506是肾移植术后BKV感染进展的独立危险因素,对于术后高危受者可采取减免该种类药物或更换为其他免疫抑制药物的措施。对移植术前对供、受者进行常规的BKV筛查是预防和减少术后进展为BK病毒血症和BKVAN的另一有效措施。对术前BKV阳性受者,术后应加大对BKV感染的监测力度,同时早期给予适当的预防性临床干预措施。
　　4、BKV感染发展至病毒血症阶段即可能影响移植肾功能,对发现BK病毒血症的受者,尤其是持续病毒血症的受者应及时进行降低免疫抑制药物等临床干预,减缓进展为BKVN的几率。
　　5、体外刺激肾移植术后受者BKV特异性细胞免疫反应以CD4+ T细胞免疫反应为主。移植受者 BKV感染发展至病毒血症阶段时,VP1、VP2、VP3三种结构蛋白体外刺激病毒特异性免疫反应的强度明显下降。
　　6、VP1和VP3两种BKV特异性蛋白体外刺激BKV特异性细胞免疫反应的强度显著高于其他BKV特异性蛋白(VP2、LT-Ag和st-Ag),提示BKV特异性免疫反应可能以VP1和VP3两种结构蛋白为主导。
　　7、肾移植受者发展至病毒血症阶段时BKV特异性免疫反应受到严重抑制,若机体不能及时恢复其抗病毒能力,则持续病毒血症状态下极易发展至 BKVN而导致移植肾功能受损甚至移植物丢失。

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英文缩略语

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前言

第一部分 尿液与血液病毒载量在肾移植受者BK病毒性肾病诊断中的应用

1.1 研究背景

1.2 对象与方法

1.3 结果

1.4 讨论

第二部分 肾移植术后早期BK病毒感染和BK病毒性肾病的流行病学观察研究

2.1 研究背景

2.2 对象与方法

2.3 结果

2.4 讨论

第三部分 肾移植术BK病毒感染的特异性免疫反应的前瞻性随机对照研究

3.1 研究背景

3.2 资料与方法

3.3 结果

3.4 讨论

第四部分 肾移植术后BKVN受者的临床特点分析及干预性治疗体会（7例报道）

4.1研究背景

4.2 资料与方法

4.3 结果

4.4 讨论

参考文献

总结

实验不足之处

肾移植术后BK病毒感染及BK病毒性肾病的特异性免疫反应研究进展综述

肾移植术后BK病毒感染和BK病毒性肾病的监测、诊断及治疗研究进展综述

研究生期间文章发表

附录

致谢