抗IL-6单克隆抗体对自身免疫性心肌炎的保护作用研究

摘要

青年人的心衰可由扩张性心肌病引起,病毒性心肌炎反复发生、迁延不愈是扩张型心肌病的常见病因。病毒性心肌炎在青少年中的患病率为8.03万/10万~41.86/10万。心肌炎的发病机制包括病毒的直接作用和机体的自身免疫反应。病毒的直接作用发生较早,进展迅速;由自身免疫所致的损伤较病毒直接损伤发生时间晚,持续时间长。包括自身反应性杀伤性T细胞、自身反应性抗体(HRA)、细胞因子介导的心肌损伤。利用猪心肌肌凝蛋白,可在易感动物Lewis大鼠上制造自身免疫心肌炎(Experimental autoimmune myocarditis, EAM)模型,能够很好的模拟人类病毒性心肌炎所致的自身免疫损伤,基于EAM大鼠的实验研究为反复感染的心肌炎所致扩心病提供了理论依据。近年来,国内外研究显示,Th17细胞、Treg细胞数量和功能上的平衡失调在自身免疫性疾病的发展过程中起到了一定的作用[1、2],而IL-6在Th17/Treg平衡重起到了决定平衡方向的关键作用。
　　研究目的：
　　1.观察白介素6单克隆抗体(IL-6 mAb)对大鼠自身免疫心肌炎(EAM)的干预疗效。
　　2.探讨白介素(interleukin,IL)-6在EAM发急性发病以及慢性持续过程中,对辅助性T细胞17/调节性T细胞(Th17/Treg)平衡的影响。
　　实验方法：
　　本研究通过对EAM大鼠以及经抗IL-6单克隆抗体干预的EAM大鼠进行心肌组织病理观察,检测两组大鼠脾细胞中Th17细胞、CD4+CD25+Treg细胞数量和功能,测定血清细胞因子,检测经 IL-6mAb刺激后的脾细胞中细胞因子分泌水平的变化,以及目的基因在疾病发生发展过程中mRNA水平的变化等。
　　实验结果：
　　炎症积分、纤维化积分、凋亡指数 IL-6mAb干预组较 EAM组明显下降(P<0.01)。
　　急性峰值期(21d组):EAM组Th17和Treg细胞数量上调,IL-6mAb干预组则受明显抑制(P<0.01);
　　血清炎症因子分泌情况:⑴急性炎症期:EAM组IL-6、IL-17和TGF-β的浓度升高,IL-6mAb干预组则明显下降(P<0.01);⑵慢性持续期:EAM组IL-17水平升高,IL-10、Treg水平降低;IL-6mAb干预组则与正常组无差异。
　　体外IL-6mAb刺激EAM源性脾细胞,培养基中IL-10、IL-17和TGF-β的水平较IgG刺激组明显降低。
　　外周血转录因子STAT3、RORγt、Foxp3 mRNA水平:急性炎症期STAT3、RORγt、Foxp3 mRNA水平上升,IL-6mAb干预组外周血STAT3、RORγt、FoxP3 mRNA水平下降(P<0.01);慢性持续期:EAM组,STAT3、RORγt mRNA水平较正常组升高,FoxP3 mRNA水平降低。IL-6mAb干预组则无明显变化。
　　结论：
　　1.抗IL-6单克隆抗体对大鼠自身免疫性心肌炎具有保护作用;
　　2. Th17、Treg细胞参与EAM急性发病过程;Th17、Treg细胞在EAM慢性持续期,表现为以Th17为主导的炎症反应过程;
　　3.抗IL-6单克隆抗体治疗大鼠自身免疫性心肌炎的机制是通过抑制Th17、Treg细胞分布及其细胞因子、转录因子表达,从而减轻心肌炎性细胞进入和纤维化。

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前言

第一部分抗IL-6单克隆抗体对自身免疫心肌炎治疗效果评价

一、实验材料

1.实验动物和分组

2. 主要仪器设备

3. 主要试剂

二、实验方法

1. EAM模型的制备

2. 病理学检测

3. 脱氧核糖核酸（DNA）缺口末端标记法（TUNEL法）凋亡检测

4. 酶联反应吸附测定（ELISA法）检测血清细胞因子IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β水平

5. 统计方法

三、实验结果

1. 三组大鼠一般情况

2. 病理学观察

3. 脱氧核糖核酸（DNA）缺口末端标记法（TUNEL法）凋亡检测

4. 酶联反应吸附测定（ELISA法）检测血清细胞因子IL-6水平

四、讨论

第二部分IL-6在自身免疫心肌炎中对Th17/Treg的影响(IL-6Ab治疗机制探讨)

一、实验材料

1.实验动物及分组

2. 主要仪器设备

3. 主要试剂

二、实验方法

1. 流式细胞术检测脾细胞Th17和Treg亚群及相关细胞因子

2. 酶联反应吸附测定（ELISA法）

3. IL-6mAb对体外EAM源性细胞因子（IL-10、IL-17、TGF-β）的影响

4. 实时定量PCR法测定外周血液STAT3、RORγt和Foxp3基因表达

5. 统计方法

三、实验结果

1. 流式细胞术检测脾细胞Th17和Treg亚群及相关细胞因子

2. 酶联反应吸附测定（ELISA法）检测血清细胞因子IL-10、IL-17、TGF-β水平

3. IL-6mAb对体外EAM源性细胞因子的影响

4.实时定量PCR法测定外周血STAT3、RORγt和Foxp3基因表达

四、讨论

参考文献

结论

缩略词表

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