人脂肪间充质干细胞的分离鉴定及向肝脏样细胞分化的实验研究

摘要

目的：探讨人脂肪间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及向肝脏样细胞分化的方法。
　　方法：将脂肪组织切成小于1mm3的碎片,用胶原酶Ⅰ消化离心法获得人脂肪间充质干细胞,然后以1×104/cm2的细胞浓度,接种于含体积分数为10％胎牛血清的低糖 DMEM培养基中,置于培养箱中进行原代培养;观察原代细胞形态及生长情况;取第5代细胞接种于24孔板中,每天消化3个孔,计算细胞数量,取其平均数绘制细胞生长曲线;取第5代细胞,胰酶消化后,用流式细胞仪检测干细胞相关表面抗原CD13、CD73、CD34、CD45和HLA-DR;取第5代细胞接种于6孔板中,实验组分别用诱导培养基向成脂及成骨方向诱导,对照组用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养,检测其多向分化潜能;取第5代细胞,接种于培养瓶及24孔板中,实验组用含有ActivinA、HGF、FGF、EGF、OSM、DMSO等细胞因子的两阶段法肝脏样细胞诱导培养基培养,对照组用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养,并观察细胞形态变化及生长情况,于诱导至第13天时,采用RT-PCR法检测肝细胞相关基因表达,采用PAS染色法检测肝脏样细胞糖原合成情况,采用细胞免疫组化法检测肝细胞相关抗原的表达。
　　结果：用消化离心法分离获取的脂肪间充质干细胞大小均匀,呈梭形的成纤维细胞样,细胞增殖良好;细胞生长曲线测定表明接种后第3天细胞进入指数增长期,第6天后生长进入平台期,体外能长期培养存活,并保持不分化状态;流式细胞仪检测表明细胞高表达CD13、CD73,低表达CD34、CD45及HLA-DR;并能被诱导成脂肪细胞及成骨细胞;上述结果表明成功构建了人原代脂肪干细胞系。人脂肪干细胞经成肝诱导后,细胞形态由梭形逐渐变为多角形或类圆形。诱导至第13天时,RT-PCR检测结果提示,实验组细胞高表达ALB、AFP、CY3P4肝细胞相关基因,而对照组细胞呈低表达及无表达状态;实验组细胞PAS染色呈红色阳性表现;细胞免疫组化证实,实验组细胞高表达肝细胞特异性抗体HepPar-1、AFP、CK18、CK19,与肝癌细胞表达相同,而对照组细胞则表现为阴性。
　　结论：利用消化离心法在体外能分离得到脂肪间充质干细胞,在体外可长期存活,反复传代,诱导后可分化为肝脏样细胞,为脂肪间充质干细胞做为细胞治疗、生物人工肝及肝组织工程的种子细胞提供理论依据。

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前言

正文

引言

1. 试验材料

2. 试验方法

结果

3.1.1 hASCs原代细胞形态学

3.1.2 hASCs细胞生长曲线

3.1.3 hASCs细胞表面抗原测定

3.1.4 hADSCs细胞多向分化潜能测定

3.2.1诱导细胞的形态学变化

3.2.2 RT-PCR法检测细胞的肝细胞相关基因表达

3.2.3 PAS染色法检测细胞的糖原合成功能

3.2.4 细胞免疫组化法检测细胞的肝细胞相关抗原

讨论

总结

参考文献

文献综述

攻读学位期间发表文章

致谢