Hedgehog-Gli1信号通路在胃癌干样细胞生物学行为中的作用及机制研究

摘要

背景:胃癌是危及我国居民生命的最常见恶性肿瘤之一。近年来随着早诊技术提高和以手术为主的综合治疗技术的发展使得胃癌患者预后得到很大改善。但是胃癌的五年生存率仍然不足30％。侵袭和转移以及耐药依然是治疗失败的主要原因。肿瘤干细胞具有自我分化、自我增殖、耐放化疗等特性，被认为是肿瘤复发转移的根源。目前多项研究表明Hedgehog-Gli1信号通路在多种不同的肿瘤干细胞的生物学特性的维持中具有重要的作用，其中Gli1是该信号通路的节点基因。为了改善胃癌患者预后、提高放化疗及基因治疗的效果，设计了该实验对胃癌干样细胞的增殖、侵袭转移、耐药等机制进行深入研究，期待为临床开发针对于临床耐药、易于转移的肿瘤细胞的治疗方法提供一些线索和思路。
　　目的:研究Gli1在胃癌干样细胞中的表达规律，发现其与胃癌干样细胞的增殖、侵袭、耐药的关系，并探讨其与其他信号通路的相互调节，探讨以慢病毒载体为基础的基因治疗在胃癌领域发展的价值。
　　方法:
　　1、培养鉴定胃癌干样细胞(cancer stem cell-like cancer cells)，通过悬浮球培养、增殖实验、体内成瘤实验，确定其肿瘤干细胞(cancer stemcells)标志物，分离出富集肿瘤干细胞的胃癌侧群细胞。
　　2、构建慢病毒干涉载体sh-Gli1-RNA，下调Gli1在胃癌干样细胞中的表达，通过qPCR和Western-blot检测Gli1表达的改变，验证干涉载体下调细胞中Gli1表达的效果。
　　3、下调Gli1前后:通过克隆形成实验、CCK8实验、Transwell实验检测胃癌干样细胞中的增殖能力、迁徙能力的影响、化疗耐受性的变化;通过流式凋亡检测分析SMO拮抗剂cyclopamine与sh-Gli1-RNA对胃癌干样细胞凋亡的影响有无差距;通过小鼠成瘤实验检测下调Gli1对胃癌干样细胞体内成瘤能力的影响。
　　4、上调ZNRF3表达:通过qPCR和Western-blot检测ZNRF3与Gli1的变化关系;通过Annexin/PI检测其对胃癌细胞及黏膜细胞增殖凋亡的影响;通过qPCR和Western-blot检测其与Bcl-2、Ki-67等凋亡、增殖蛋白的相互调节关系;在原代胃癌细胞中检测ZNRF3与Gli1表达。
　　结果:
　　1、培养鉴定胃癌干样细胞，悬浮球培养、增殖实验、体内成瘤实验，确定CD44+CD54+是胃癌干细胞的标志物，CD44+CD54+的胃癌细胞是富集胃癌干细胞的侧群细胞。
　　2、下调Gli1在胃癌干样细胞中的表达后，悬浮球实验、qPCR和Western-blot检测结果均显示Gli1表达下降，证明转染效率佳。
　　3、下调Gli1可以引起以下变化:通过克隆形成率实验、CCK8实验结果、Transwe1l实验检测、小鼠成瘤实验显示胃癌干样细胞的增殖能力、迁徙能力、化疗耐药、体内成瘤能力均降低。流式凋亡检测分析显示sh-Gli1-RNA比cyclopamine对胃癌干样细胞凋亡的降低作用更显著。
　　4、调高ZNRF3表达后:qPCR和Western检测发现Gli1的变化下降;Annexin/PI检测发现上调ZNRF3可增加胃癌细胞及黏膜细胞增殖凋亡，对胃癌细胞影响更为显著;qPCR和Western检测发现上调ZNRF3可以降低Bcl-2、Ki-67表达;在原代胃癌细胞中检测ZNRF3与Gli1表达负相关。
　　结论:
　　1、Gli1参与调控胃癌干样细胞的自我增殖、耐药、体内成瘤。
　　2、下调Gli1的表达可以有效地抑制胃癌干样细胞的增殖、侵袭能力、化疗耐药性、动物体内成瘤能力。
　　3、Hedgehog信号通路还能受抑癌基因ZNRF3的调控，上调ZNRF3可以下调Gli1的表达，进而增加胃癌干样细胞的凋亡。
　　4、Gli1在胃癌干样细胞的增殖、侵袭、耐药和体内成瘤能力方面起到重要的作用。因此，Gli1可以成为治疗的靶点。Sh-Gli1-RNA慢病毒载体是一种值得开发的治疗胃癌的手段。
　　5、ZNRF3可以降低Gli1的表达，我们推测ZNRF3可能通过改变Gli1的表达进而影响胃癌干样细胞的生物学行为，值得进一步研究。

目录

声明

英文缩略词汇对照

摘要

前言

参考文献

第一部分 胃癌干细胞的分离和鉴定

一 引言

二 材料与方法

三 结果

四 讨论

参考文献

第二部分 shRNA下调胃癌干样细胞Gli1基因表达对其克隆形成、细胞增殖、迁徙能力、化疗耐受性的影响

一 引言

二 材料与方法

三 结果

四 讨论

参考文献

第三部分 ZNRF3对Hedgehog-Gli1信号通路的调节作用

一 引言

二 材料与方法

三 结果

四 讨论

参考文献

全文结论

文献综述 胃癌的综合治疗进展

攻读学位期间发表文章情况

致谢