光动力疗法抗多重耐药铜绿假单胞菌感染的研究

摘要

目的: 研究钌化合物对铜绿假单胞菌的光动力（Photodynamic therapy, PDT）杀伤作用，初步观察其在体抗感染效果。
　　方法:
　　(1)铜绿假单胞菌ATCC27853、PAO1和3株临床分离的PA1、PA2、PA3，配成108CFU/ml细菌悬液，将Ru光敏剂(PS)按不同浓度与其混合后孵育30 min，用波长457 nm激光，功率密度40 mW/cm2，照射时间10 min进行PDT处理，另设完全空白、单纯光敏剂、单纯照光对照组。各组在处理后采用稀释平板法计数观察PDT对浮游菌的杀伤作用。并电镜观察PDT后细菌超微结构的变化。
　　(2)培养PAO1生物被膜，进行PDT处理（照光参数同上）。处理后采用结晶紫染色光镜观察PAO1生物被膜结构变化，MTT法检测细菌活性。另设单纯光敏剂、单纯照光和完全空白对照组。以扫描电镜观察生物被膜经PDT处理后超微结构的改变。
　　(3)测定加入外排泵抑制剂前后PDT对铜绿假单胞菌PA1和PAO1的杀伤。根据加入PAβN和光敏剂的先后顺序，分为单纯PS、同时加入、先外排泵抑制剂(Efflux pump inhibitor, EPI)后PS和先PS后EPI组，PDT处理后，测定细菌活性。同时采用吸收光谱法检测各组中与细菌结合的PS含量。
　　(4)采用胶带撕脱法建立小鼠皮肤PAO1感染模型，将24只感染小鼠分为PDT和单纯感染组，每组12只。PDT后即刻、24h剪取感染皮肤(n=6)，平板计数单位皮肤中的细菌数。PDT后观察大体变化，行病理组织学检查(n=3)。
　　结果:
　　(1)不同浓度Ru-PDT对5株铜绿假单胞菌均有杀伤。光敏剂在浓度10μM时，5株铜绿假单胞菌活性均降低4 Log以上。电镜观察发现，PDT后细菌内外膜遭到破坏，胞内容物从膜结构上的裂缝中释放。
　　(2)随光敏剂浓度的增加，生物被膜内细菌活性在PDT处理后降低。在相同PDT条件下，Ru-PDT对被膜内细菌的作用较对浮游菌弱。25μ M-PDT处理可明显破坏生物被膜结构的完整性，清除菌体及胞外基质。
　　(3)加入PAβN可增强PDT的作用效果。先加PAβN再加PS组PDT对细菌的杀伤作用最强，与细菌结合的光敏剂含量最高。先加PS再加PAβN时，PDT杀伤效果最差。
　　(4)PDT后细菌负荷明显低于空白对照组(p＜0.01)，并达到了有效杀伤标准（细菌数降低＞3 Log）。24h时有细菌再生长现象，但PDT处理后24h细菌负荷仍然低于感染2h和24h组。PDT处理后小鼠皮肤创面有明显的缩小。
　　结论:
　　1.Ru-PDT具有杀伤铜绿假单胞菌的作用，其机制可能是通过破坏细菌膜结构的完整性引起胞质成分外泄，导致细菌死亡。
　　2.Ru-PDT具有杀伤铜绿假单胞菌生物被膜内细菌及破坏被膜的作用。PDT对生物被膜内细菌的杀伤比对浮游菌的杀伤弱。
　　3.外排泵抑制剂PAβN可以增强Ru-PDT作用，可能是通过抑制细菌外排泵，减少光敏剂排出菌体外而起作用。
　　4.PDT干预可有效杀伤皮肤感染灶内病菌，减少炎症反应，促进创面愈合。

目录

声明

英文缩略词表

摘要

前言

第一部分：Ru-PDT对5株耐药性不同的铜绿假单胞菌的体外杀伤及作用位点观察

引言

一．材料与方法

二．结果

三．讨论

四．小结

第二部分：Ru-PDT对铜绿假单胞菌生物被膜的作用

引言

一．材料与方法

三．结果

三．讨论

四．小结

第三部分：铜绿假单胞菌外排泵抑制剂对Ru-PDT作用的影响

引言

一．材料与方法

二．结果

三．讨论

四．小结

第四部分 Ru-PDT在体抗感染效果观察

引言

一．材料与方法

二．结果

三．讨论

四．小结

结论与展望

参考文献

文献综述 光动力治疗铜绿假单胞菌感染研究进展

攻读学位期间发表文章情况

致谢