hESCs来源视杯样组织中C-kit+/SSEA-4-祖细胞的细胞生物学特性研究

摘要

视网膜变性类疾病常引起感光细胞、视网膜色素上皮(RPE)细胞等多种视网膜细胞变性、死亡。由于二者均不可再生，移植正常的视网膜组织或者细胞，被认为是目前治疗此类疾病最有前景的方法。许多研究者尝试将干细胞分化为视网膜细胞后进行移植，可避免成瘤性风险，但单一种类终末分化的细胞移植无法解决视网膜色素变性(RP)患者视网膜中多种细胞丢失的难题。
　　研究表明肺、肾等器官来源的c-kit+（干细胞因子受体）细胞可跨胚层分化，具有明显的器官特异性。Sasai等更是利用三维培养技术在体外成功诱导胚胎干细胞(ESCs)形成与体内正常胚胎发育相似的视泡(OV)样、视杯(OC)样组织。推测hESC(hESC)来源的OV、OC样组织中c-kit+细胞是具有向多种视网膜细胞分化能力的视杯特异性祖细胞，可能成为治疗视网膜变性类疾病的新型种子细胞。考虑到种子细胞的不可控增殖、成瘤等安全因素，我们同时筛除其中阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)阳性的未分化细胞。
　　本实验首先采用三维培养技术诱导hESC形成OV、OC样组织，并对其c-kit、SSEA-4的时空表达特点进行研究，然后对OC样组织中c-kit+/SSEA-4-细胞的细胞生物学特性进行研究，从而为视网膜变性类疾病的治疗提供理论依据。
　　目的:
　　1.观察不同时间点三维培养OV、OC样组织中c-kit、SSEA-4的空间表达特点及发育学变化规律;
　　2.通过流式细胞仪分选三维培养OV、OC样组织中的c-kit+/SSEA-4-细胞，并对其自我更新、增殖能力及多向分化潜能进行鉴定。
　　方法:
　　1.采用三维培养技术诱导hESC H1细胞系形成OV、OC样组织，并通过免疫荧光染色分析OV、OC样组织中Pax6、Mitf Rax、Crx等相关标记物的表达情况;
　　2.通过免疫荧光染色及流式细胞仪共同检测hESC三维培养和诱导第7、14、21、30、49、70、90d OV、OC样组织中c-kit、SSEA-4的时空表达规律;
　　3.流式细胞仪分选三维培养第30天OC样组织中的c-kit+/SSEA-4-细胞，通过免疫荧光鉴定第二代P2(Passage2)、P4、P6细胞Pax6、Nestin、Sox2等干细胞标记物及增殖指标Ki67的阳性率，同时检测其细胞周期;诱导P3c-kit+/SSEA-4-细胞的分化，通过免疫荧光鉴定c-kit+/SSEA-4-细胞分化为感光细胞、神经节细胞及RPE细胞的潜能。
　　结果:
　　1.hESC三维培养第14天可见Rax+ OV样组织，第30天形成具有内层Pax6+、外层Mitf+的双层OC样结构，第90天可见部分Crx+细胞。
　　2.c-kit主要表达于hESC来源OV及OC的神经上皮样结构中，SSEA-4早期均匀表达于整个组织，晚期则主要集中于周边部。c-kit+细胞比例呈先升高后下降的趋势，并在分化第14d达40％的峰值。SSEA-4+细胞比例从分化0d至70d呈持续下降)趋势，直到90d一直维持于该低水平。
　　3.hESC三维培养第30天，类OC样组织中的c-kit+/SSEA-4-细胞P2时Pax6、Nestin、Sox2阳性率分别为47.00％、63.90％、7.27％，随着细胞的传代，各指标阳性率稍有下降;Ki67阳性率在P2、P4、P6代分别高达75.61％、65.78％、60.80％,细胞周期检测结果显示G0/G1期细胞比例P2时达92.5％，后随传代而逐渐下降;P3代细胞经定向诱导分化后，免疫荧光染色结果显示其可表达感光细胞标记物Recoverin、神经节细胞标记物Tuj1、及胶质细胞标记物GFAP和GS。
　　结论:
　　1.hESC H1细胞系可分化为高表达Rax的类OV样组织，以及具有RPE层和神经视网膜(neuroretina，NR)层的类OC样组织;
　　2.三维培养hESC来源类OV、OC样组织中，c-kit在诱导分化过程中被激活，主要表达于NR层，c-kit+细胞比例呈先增高后下降趋势;SSEA-4早期高表达于整个组织，之后逐渐减少并局限于周边部并维持于低水平状态;
　　3.hESC三维培养第30天，类OC样组织中的c-kit+/SSEA-4-细胞表现出与视网膜祖细胞(retinal progenitor cell，RPCs)特征相符的增殖及多向分化潜能，可分化为感光细胞、神经节细胞及胶质细胞。随传代次数增加，其自我更新及增殖能力均有所下降。

目录

声明

论文说明

缩略词表

摘要

前言

第一部分 hESCs三维诱导为视杯样组织

前言

材料和方法

结果

讨论

第二部分 hESCs来源视杯样组织中c-kit和SSEA-4的时空表达特点

前言

材料与方法

结果

讨论

第三部分 hESCs来源视杯样组织中c-kit+／SSEA-4-祖细胞的细胞生物学特性研究

前言

材料与方法

结果

讨论

全文结论

参考文献

文献综述 干细胞三维培养研究进展

攻读学位期间发表文章情况

致谢