仿生关节软骨细胞外基质(ACECM)取向支架和ChondrO-Gide支架特性的比较

摘要

目的:比较仿生关节软骨细胞外基质(ACECM)取向支架和Chondro-Gide双层支架的生物学特性;评价仿生关节软骨细胞外基质ACECM取向支架和Chondro-Gide(C-G)双层支架复合自体关节软骨细胞植入兔关节软骨缺损修复软骨损伤的效果，以期为临床应用提供优选和改进的组织工程软骨支架。
　　材料方法:取猪关节软骨，经湿法粉碎，差速离心，收集去细胞后的纳米级软骨细胞外基质ECM，获得关节软骨去细胞源性支架材料。运用定向结晶、冷冻干燥、物理、化学方法交联技术，制成乳白色三维多孔海绵状取向支架(ACECM支架)。Chondro-Gide支架购自瑞士，为猪皮肤胶原制作的双层支架。将两种支架采用下述方法进行生物学特性比较。
　　（一）两种支架物理特性的比较:用光镜(LEM)和扫描电镜(SEM)观察两种支架表面的物理特性，包括孔径大小、孔道结构、孔隙率;比较两种支架的吸水膨胀率及生物力学特性。
　　（二）将两种支架复合兔软骨细胞后做定性观察:包括活细胞在支架上的生长状态;甲苯胺蓝(TO)、番红花O、奥新蓝（AB）组化染色，Ⅰ、Ⅱ型胶原抗体免疫组化染色观察其基质。
　　（三）将两种支架复合兔软骨细胞后做定量分析:包括细胞在支架上生长情况（MTT法）;细胞粘附率检测;羟脯氨酸总胶原蛋白定量;GAG定量;RT-PCR定量测定在支架上生长细胞的增殖数及表型。
　　（四）将两种支架植入大鼠皮下后分别于1、2、4周取材，镜下观察两种支架植入体内组织中可能的炎症和免疫反应。
　　（五）取新西兰大白兔30只，随机分成5个组，手术建立关节软骨缺损动物模型，用分离培养的第三代兔关节软骨细胞复合ACECM取向支架和Chondro-Gide双层支架植入兔关节软骨全层缺损，分别在手术后3月和6月后取材，通过对新生软骨组织的大体观察、组织学观察和评分、GAG检测，验证这两种支架修复关节软骨缺损的可行性。
　　（六）统计学分析。
　　结果:ACECM取向支架:大体为圆形和圆柱形，乳白色海绵状，扫描镜下观察具有纵取向平行排列的孔道结构，孔径:150-260μm，孔隙率:91.75±3.73％;吸水膨胀率:35-45％,生物力学压缩刚度:6.674±0.470 N/mm;弹性模量:3.303±0.233MPa。兔软骨细胞复合支架后培养3天，活细胞荧光染色有大量活细胞生长。冰冻切片甲苯胺蓝、番红花O、奥新蓝组化染色均为阳性。Ⅱ型胶原免疫组化染色为阳性、Ⅰ型胶原为阴性。定量分析:MTT毒性检测为Ⅰ级。细胞复合支架后的粘附率:3hr为68％，6hr为86％。支架加细胞后羟脯氨酸定量:10.42±2.73 ug/mg，GAG含量:25.12±4.12 ug/mg，DNA含量:10.52±5.79 ug/mg，RT PCR定量测定:RNA-0.2479, ColⅠ:0.412±0.1421, ColⅡ:4.312±0.5412, Aggrecan:3.761±0.4123,Sox-9:0.576±0.0812，Col X:0.132±0.0541。支架植入大鼠皮下后轻度炎症反应，无免疫反应。
　　Chondro-Gide支架:为乳白色，大体为方形，光镜、扫描电镜下观察可见表层胶原呈致密横向排列，孔径:40-100μm。里层见疏松毛状粗胶原，呈网状，孔径:50-180μm。孔隙率:67.75±2.73％，吸水膨胀率:10-15％。生物力学压缩刚度:2.738±0.409 N/mm，弹性模量:1.355±0.202MPa。定性观察:支架复合兔软骨细胞培养3天后活细胞荧光染色表面有孔处活细胞生长良好。致密处细胞稀疏。从定量分析可以得出:支架MTT毒性检测为Ⅰ级。细胞粘附率:3hr为52％，6hr为74％。羟脯氨酸定量:2.09±1.05 ug/mg，GAG含量为:21.74±5.79 ug/mg，DNA含量为:7.31±4.37 ug/mg。RT PCR测定值:RNA-0.1547，ColⅠ:1.63±0.2145，ColⅡ:0.242±0.1163, Aggrecan:1.261±0.1321, Sox-9:3.075±0.4121, Col X:7.561±1.2145。支架植入大鼠皮下后轻度炎症反应，无免疫反应。
　　两种支架分别复合兔软骨细胞修复关节软骨缺损的结果:空白组、单纯支架组修复效果明显不如软骨细胞复合取向支架组和软骨细胞复合Chondro-Gide组。利用SPSS10.0软件，完全随机设计的方差分析对5组3月、6月取材时间的大体评分结果进行统计学分析，结果显示:差异有显著性意义，说明不同时间段标本的修复效果有统计学意义。两两比较6月组软骨细胞复合取向支架组和软骨细胞复合Chondro-Gide组差异P＞0.05，没有统计学意义。组织学评分结果显示:利用SPSS10.0软件，完全随机设计的方差分析对五组支架组3月、6月各个取材时间的组织学评分结果进行统计学分析，结果显示:差异有显著性意义，说明不同时间段标本修复效果有统计学意义，两两比较以软骨细胞复合取向支架组效果最好。GAG检测结果经完全随机设计的方差分析结果显示，软骨细胞取向支架组、软骨细胞Chondro-Gide组、正常关节软骨组在各时间点取材标本的GAG含量均有差别，差异具有统计学意义。软骨细胞取向支架组GAG含量高于软骨细胞Chondro-Gide组(3月、6月)，但两者均低于正常关节软骨组。
　　结论:两种支架各有特点:ACECM支架组海绵多孔支架呈纵取向排列，表面横向孔径的大小、孔隙率、吸水膨胀率、细胞粘附率、GAG、Aggrecan、Ⅱ型胶原的含量均高于C-G支架组，作为软骨组织工程修复关节软骨材料更具有优越性。C-G支架组因上表层孔隙小，胶原排列紧密，下表层表面胶原纤维呈绒毛状，有利于细胞粘附，在修复关节软骨缺损手术中，对防止细胞外漏具有应用价值。在全部体内修复组中效果最好的是自体软骨细胞复合ACECM支架组修复软骨缺损。而效果最不理想的就是空白缺损和单纯支架移植组。虽然大体观察结果显示软骨细胞取向支架组和软骨细胞C-G组差异无统计学意义，但从这两者修复的组织学观察具有显著性差异（从组织学评分和GAG定量对比结果也可以看出）。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 仿生关节软骨细胞外基质ACECM取向支架和Chondro-Gide支架生物学特性的比较

材料与方法

实验结果

讨论

附图一

第二部分：体外培养兔关节软骨细胞复合ACECM取向支架和

材料和方法

实验结果

讨论

附图二

文献综述：关节软骨组织工程进展

参考文献

缩略词表

攻读学位期间发表文章情况

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